將生物酶約束或限制在一定空間，使變成不溶於水、仍保持酶的催化活性的一類酶製劑。1953年N.格魯佈霍費爾等開始研究酶的固定化，1969年千畑一郎等將固定化的氨基醯化酶用於工業上拆分D，L-氨基酸。此後，固定化酶的研究工作取得迅速進展。目前，這類酶製劑在工業生產中已得到廣泛的應用。
將酶固定化的方法主要有四種：
① 吸附法 通過物理吸附或靜電引力將酶吸附在活性炭、氧化鋁、離子交換樹脂、DDEAE-葡聚糖凝膠等具有活潑表面的載體上（圖a）。
此法的優點是簡便，載體可再生使用；缺點是結合不牢，使用中容易脫落。
② 共價法 通過酶分子上的官能團，如氨基、羧基、羥基、酚基、巰基、咪唑基，將酶分子通過共價鍵結合於天然或合成高聚物載體上(圖b)。此法的優點是酶與載體結合牢固，酶分子不會脫落；缺點是反應條件有時較劇烈，可能降低酶的活性。
③ 交聯法 利用雙功能試劑如戊二醛等，將酶分子交聯起來，使成網狀結構而不溶於水（圖c）。
④ 包埋法 將酶包藏在凝膠的網格中，或包藏在半透性的微型膠囊中（圖d）。此法較簡便，由於隻是將酶分子包藏起來，未起化學反應，固定化酶具有較高的活力。
酶經過固定化後，穩定性普遍有所提高，而且有良好的機械強度，可像離子交換樹脂那樣反復使用，彌補瞭天然酶易失活、易污染產物、難回收使用等缺點；但酶的催化活力和選擇性相對下降。
固定化酶已用於L-氨基酸、糖、核苷酸、抗生素等有機化合物的生產；在分析化學上，利用固定化酶可以準確而靈敏地測定一個復雜體系中的某一成分的含量；在醫療上，可用於治療多種先天性的缺酶疾病，能避免免疫反應。此外，固定化酶也可作為天然酶的一種模型，從理論上研究細胞中酶的作用方式。