用物理或化學方法處理水溶性的酶使之變成不溶於水或固定於固相載體的但仍具有酶活性的酶衍生物。在催化反應中，它以固相狀態作用於底物，反應完成後，容易與水溶性反應物分離，可反復使用。固定化酶不但仍具有酶的高度專一性和高催化效率的特點，且比水溶性酶穩定，可較長期使用，具有較高的經濟效益。將酶製成固定化酶，作為生物體內的酶的模擬，可有助於瞭解微環境對酶功能的影響。
固定化酶在文獻中曾用水不溶酶、不溶性酶、固相酶、結合酶、固定酶、酶酶樹脂及載體結合酶等名稱。
酶的催化反應依賴於它的活性部位的完整性，因此在固定某一酶時必須選擇適當條件，使其活性部位的基團不受影響，並避免高溫、強酸及強堿等條件，不使蛋白質變性。酶的固定化方法簡述於下：
載體結合法 最常用的是共價結合法，即酶蛋白的非必需基團通過共價鍵和載體形成不可逆的連接。在溫和的條件下能偶聯的蛋白質基團包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、絲氨酸和蘇氨酸的羥基。參加和載體共價結合的基團，不能是酶表現活力所必需的基團。以中國首先采用的雙功能團試劑“對位-β-硫酸酯乙砜基苯胺”偶聯載體和酶為例，載體結合的步驟如下頁反應式。
此法曾先後用於3′-核糖核酸酶、5′-磷酸二酯酶和葡萄糖淀粉酶等的固定化。此外酶通過物理吸附或離子吸附於載體制備固定化酶也是常用的方法。
交聯法 依靠雙功能團試劑使酶分子之間發生交聯凝集成網狀結構，使之不溶於水從而形成固定化酶。常采用的雙功能團試劑有戊二醛、順丁烯二酸酐等。酶蛋白的遊離氨基、酚基、咪唑基及巰基均可參與交聯反應。
包埋法 酶被裹在凝膠的細格子中或被半透性的聚合物膜包圍而成為格子型和微膠囊型兩種。包埋法制備固定化酶除包埋水溶性酶外還常包埋細胞，制成固定化細胞，例如可用明膠及戊二醛包埋具有青黴素酰化酶活力的菌體，可連續水解帤基青黴素，工業生產6-氨基青黴烷酸。
酶經過固定化後，比較能耐受溫度及pH的變化，最適pH往往稍有移位，對底物專一性沒有任何改變，實際使用效率提高幾十倍（如5′-磷酸二酯酶的工業應用）甚至幾百倍（如青黴素酰化酶的工業應用）。
固定化酶的形式多樣，可制成機械性能好的顆粒裝成酶柱用於連續生產；或在反應器中進行批式攪拌反應；也可制成酶膜、酶管等應用於分析化學；又可制成微膠囊酶，作為治療酶應用於臨床。現在又有人用酶膜（包括細胞、組織、微生物制成的膜）與電、光、熱等敏感的元件組成一種裝置稱生物傳感器，用於測定有機化合物和發酵自動控制中信息的傳遞及環境保護中有害物質的檢測。最常用的是酶膜與離子選擇電極組成的生物傳感器，例如脲傳感器是由固定化脲酶、固定化硝化菌及氧電極組成，脲經脲酶分解成氨及二氧化碳，氨又繼續被硝化菌氧化，總耗氧量則通過氧電極反映出電流的變化，用以計算脲的含量。
