微生物純培養的搜集、分類和管理。它兼具活標本館、基因庫的作用。任務是:①廣泛搜集在科學研究與生產中有價值的菌和菌株;②研究它們的生物學特性;③研究和採取妥善的保藏方法,使菌種不死、不污染並盡可能少發生變異;④編制菌種目錄,為掌握和利用微生物資源提供依據。

  菌種保藏的要點是:①選擇適宜的培養基、培養溫度和菌齡,以便得到健壯的細胞或孢子;②保存於低溫、隔氧、乾燥、避光的環境中,儘量降低或停止微生物的代謝活動,減慢或停止生長繁繁殖;③不被雜菌污染,在較長時期內保持著生活能力。

  方法和原理 定期移植法 將菌種接種於所要求的培養基上,在最適溫度中培養,至靜止期或產生成熟的孢子時,置入5℃的冰箱(或冰庫)保存。在培養和保存的過程中,由於代謝產物的累積而改變瞭原菌的生活條件,結果菌落群體中的個體就不斷衰老和死亡,因此每5~15天或1~4個月重新移植一次,具體間隔時間因種而異。凡能人工培養的微生物都可用此法保存。此法不需特殊設備,但煩瑣,費時,而且經常移植容易引起菌種退化。

  礦油封藏法 將化學純的液體石蠟(礦油)經高壓蒸氣滅菌,放在40℃恒溫箱中蒸發其中的水分,然後註入斜面培養物中,使液面高出斜面約1厘米。將試管直立,放在15~20℃室溫中保存。由於在斜面培養物上覆蓋一層液體,既能隔絕空氣,又能防止培養基因水分蒸發而幹燥,可以延長菌種保藏的時間。但註入的液體必須不與培養基混溶、對菌種無毒,不易被利用和揮發。此法適用於酵母菌、芽孢桿菌;不適用於固氮菌、乳酸桿菌、明串珠菌、法門氏菌和毛黴目中的大多數屬種。此法簡便易行,但必須註意防火和污染。

  沙土管法 將沙或土過篩、烘幹、裝管、滅菌、然後將菌種制成孢子懸液滴入其中混勻,放到盛氯化鈣的幹燥器裡吸除水分,幹燥後保存或用火焰封管後保存。吸附在幹燥沙土上的孢子因缺水而處於休眠狀態,可保存較長時期。此法適用於芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌、放線菌、鐮刀菌等。

  麩皮法 將麩皮制成培養基,培養要保存的菌種,待生長良好後,置幹燥器中保存。這是根據中國釀造酒、醋、醬時制曲的經驗所采用的一種保藏方法,適用於谷物微生物區系中的種類。

  L-幹燥法 又稱液體幹燥法或真空幹燥法。用含3%谷氨酸鈉的0.1M磷酸緩沖溶液(pH7.0)做分散媒,將待保藏的微生物制成高濃度的細胞懸液,滴入無菌安瓿瓶中,每管0.05毫升;將安瓿瓶固定在多歧管上,並以水浴保持安瓿瓶內樣品溫度為10℃,在13.3~1.3帕的真空度下幹燥,火焰封管保存。此法不經凍結,用真實泵迅速抽幹,可避免菌種的凍傷或死亡。廣泛應用於病毒、噬菌體、細菌、酵母菌、藍藻、原生動物等。

  梭氏法 將容有1滴細胞懸液的小管,置於盛有氫氧化鉀或五氧化二磷吸水劑的大試管中,用真空泵抽至1.3帕時,將大試管密封保存。這是為減少細胞死亡率而采取的一種不經凍結、緩慢脫水的幹燥保藏法,適用於多種細菌、真菌。

  冷凍真空幹燥法 將細胞懸液每0.1~0.2毫升註入一無菌安瓿瓶,於-40℃預凍1小時,再於-20~30℃、真空度為13.3帕的條件下脫水。在脫水過程後期,安瓿瓶外溫度可逐漸升至25℃。脫水後的樣品含水量應在3%以下。最後,將安瓿瓶保持真空度1.3帕,用火焰溶封,置10℃保存。為防止細胞在凍結和脫水過程中損傷或死亡,要用保護劑制備細胞懸液。保護劑有脫脂牛奶、血清、10%蔗糖或葡萄糖溶液等,其作用是通過氧和離子鍵對水和細胞所產生的親合力來穩定細胞成分的構型。此法適用於病毒、衣原體、枝原體、細菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌等的長期保存,是當前保藏菌種的一個重要方法。但是,鹽桿菌、發光桿菌、粘桿菌、阿舒囊黴、多囊黴、擔子菌中的大多數屬種不適用於此法保存。

  液態氮超低溫凍結法 用甘油或二甲亞砜(DMSO)作保護劑制備細胞懸液,分裝入無菌安瓿瓶,每管0.2毫升,在控制溫度下降速率為1℃/分鐘的條件下預凍至-40℃,然後立即放入液氮生物貯存罐中氣相(-150℃)保存。恢復培養時,先直接侵入38℃水浴中解凍5~10分鐘,再種植於適宜培養基內培養。這是根據在低於-130℃時一切生化反應處於停止狀態、微生物也不能進行代謝活動而設計的凍結法。為避免凍死、凍傷和細胞內形成大量冰晶,用保護劑制備懸液並控制預凍時的冷卻速率和解凍時融化速率。微生物的大多數屬種適於慢速凍結和快速解凍。此法適用於病毒、枝原體、各種細菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌、藍藻等。

  分工和機構 菌種保藏可按微生物各分支學科的專業性質分為普通、工業、農業、醫學、獸醫、抗生素等保藏管理中心。此外,也可按微生物類群進行分工,如沙門氏菌、弧菌、根瘤菌、乳酸桿菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌、藻類等保藏中心。

  目前,世界上約有550個菌種保藏機構。其中著名的有①美國菌種保藏中心(簡稱ATCC,馬裡蘭):1925年建立,是世界上最大的、保存微生物種類和數量最多的機構,保存病毒、衣原體、細菌、放線菌、酵母菌、真菌、藻類、原生動物等約29000株,都是典型株;②荷蘭真菌菌種保藏中心(簡稱CBS,得福特):1904年建立,保存酵母菌、絲狀真菌約8400種、18000株,大多是模式株;③英國全國菌種保藏中心(簡稱NCTC,倫敦):保存醫用和獸醫用病原微生物約2740株;④英聯邦真菌研究所(簡稱CMI,薩裡郡):保存真菌模式株、生理生化和有機合成等菌種2763種,8000株;⑤日本大阪發酵研究所(簡稱IFO,大阪):保存普通和工業微生物菌種約9000株;⑥美國農業部北方利用研究開發部(北方地區研究室,簡稱NRRL,伊利諾伊州皮契裡亞):收藏農業、工業、微生物分類學所涉及的菌種,包括細菌5000株,絲狀真菌1700株、酵母菌6000株。

  1970年8月在墨西哥城舉行的第10屆國際微生物學代表大會上成立瞭世界菌種保藏聯合會(簡稱WFCC),同時確定澳大利亞昆士蘭大學微生物系為世界資料中心。這個中心用電子計算機儲存全世界各菌種保藏機構的有關情報和資料,1972年出版《世界菌種保藏名錄》。

  中國於1979年成立瞭中國微生物菌種保藏管理委員會(簡稱CCCCM,北京)。

  

參考書目

 中國科學院微生物研究所:《菌種保藏手冊》,科學出版社,北京,1980。