利用顯微設備觀察微小物體形態結構和對細胞或分子進行顯微操作的技術。包括顯微觀察技術顯微操作技術。顯微觀察技術是指利用光學系統或電子光學系統設備,觀察肉眼不能分辨的微小物體形態結構及其特性的技術。包括:①各種顯微鏡的基本原理、操作和應用技術;②顯微鏡樣品的製備技術;③觀察結果的記錄、分析和處理技術等。顯微操作技術是指利用顯微操作儀,對細胞或分子進行顯微操作的技術。包括:①顯微註射技術;②細胞核移植技術;③③胚胎幹細胞技術等。

  顯微鏡的產生和發展 最早設計制造的顯微鏡是以可見光為光源的光學顯微鏡。早在1610年,意大利物理學傢伽利略就曾用自制的復式顯微鏡觀察昆蟲的復眼。荷蘭人A.van列文虎克一生制作瞭247架顯微鏡,觀察瞭許多細菌、原生動物和動植物組織,是用顯微鏡作科學觀察的第一人。1872~1873年,德國物理學傢和數學傢E.阿貝提出瞭光學顯微鏡的完善理論,從此鏡頭的制作可按預先的科學計算進行。同時,德國化學傢O.肖特研制出供制作透鏡的優質光學玻璃,從而為光學顯微鏡的進一步發展奠定瞭基礎。1886年C.蔡司等研制成功具有復消色差油鏡的現代光學顯微鏡,從而達到瞭光學顯微鏡的分辨限度。從19世紀後期至20世紀60年代發展瞭許多類型的光學顯微鏡,如:偏振光顯微鏡暗視場顯微鏡相差顯微鏡幹涉差顯微鏡熒光顯微鏡等。此外,還有許多特殊裝置的顯微鏡,如倒置顯微鏡。20世紀80年代後期又發展瞭一種激光掃描共焦顯微鏡,結合圖像處理,可以直接觀察活細胞的立體圖,是光學顯微鏡的又一大進步。

  1934年M.諾爾E.魯斯卡制造成功第一臺透射電子顯微鏡。電子顯微鏡以電子束為照射源,用電子透鏡代替玻璃透鏡,從而大大提高瞭分辨率。1934年L.馬頓發表瞭用鋨酸固定的茅膏菜葉子切片的電鏡圖,1949年A.克勞德等獲得瞭第一張細胞亞顯微結構電鏡圖。到20世紀50年代,透射電子顯微鏡在生物學研究中已被廣泛應用,分辨率也由最初的50納米提高到小於0.2納米。20世紀50年代英國又首先研制成功瞭掃描電子顯微鏡。它是利用物體反射的電子來成像的,相當於光學顯微鏡的反射像。掃描電子顯微鏡景深大,放大倍率連續可變,特別適用於研究微小物體的立體形態和表面的微觀結構。70年代以來,掃描電鏡發展很快,已成為研究物質表面結構的有力工具。掃描電鏡的分辨率也由最初的50納米提高到5~3納米。電子顯微鏡的另一發展是研制超高壓電鏡以增加分辨率和對樣品的穿透力。現已研制成3兆伏加速電壓的超高壓電鏡,可用來研究整體細胞和物質的分子或原子結構。

  顯微樣品制備技術 1714年列文虎克用藏紅花對肌纖維切片進行染色,這一簡單的切片和染色是制片技術的萌芽。經過100多年的科學實踐,到19世紀中期,顯微制片技術已逐步完善。1863年W.瓦爾代爾發現用蘇木精染色可以很好地顯示染色體。1869年,E.克萊佈斯最先采用石蠟作為切片支持物來包埋材料,在此基礎上發展為石蠟切片法。這些重要的制片方法至今仍在使用。透射電鏡樣品制作的原理和操作與顯微制片相似。1949年紐曼采用二甲烯丙酸酯作為電鏡樣品切片的介質,獲得瞭初步成功。1950年拉塔和哈特曼偶然發現玻璃刀適合於超薄切片,從此玻璃刀成為電鏡切片的主要用刀並且至今還在使用。1952年G.E.帕拉德采用四氧化鋨為固定劑得到瞭良好的電鏡圖像。1953年K.R.波特和佈盧姆首先采用超薄切片機制作超薄切片。後來又發現重金屬染色可以增強電子圖像的細節,從而發展瞭現在廣泛使用的電子染料。掃描電鏡的樣品制備比較簡單,幹燥的樣品僅需金屬塗膜使樣品表面導電即可。一般來說生物樣品制備需固定、脫水、幹燥和塗膜等步驟。

  觀察結果的記錄、分析和處理 光學顯微鏡和電子顯微鏡下所見顯微圖像及其顯示的信息,有些可以直接用肉眼觀察和識別,有些則不能直接看到和識別,因此對所獲得的信息的接受、分析和處理十分重要。光學顯微鏡觀察到的圖像可以用肉眼接受和識別,因此用顯微攝影、顯微錄像等方法即可準確記錄。對電子顯微鏡來說,因為其分辨率極高,在圖像和樣品的真實情況之間,在接收和顯示中可能發生各種誤差,不加校正與分析就無法獲得理想的圖像和作出正確的解釋。這種對生物樣品電子圖像進行處理和分析的技術稱為生物圖像處理技術。顯微技術愈是深入發展,圖像處理技術愈顯重要。

  顯微註射技術 對活細胞的顯微註射最初起始於20世紀前半葉,首先應用於電生理研究。根據顯微註射的對象不同,可分為:細胞的顯微註射和生物分子的顯微註射,前者包括顯微受精技術和核移植技術等。後者主要包括核酸註射(DNA和RNA)及純化蛋白的註射等。顯微註射技術無論在體外受精、轉基因動物等應用研究,還是在基因表達、信號轉導或細胞骨架等基礎理論研究方面都具有極為重要的意義。

  顯微受精技術 20世紀80年代後期發展起來的一種新型的體外受精技術,即將精子或生精細胞直接註入卵母細胞胞質內或卵周隙來實現受精的過程。通過顯微受精技術已分別實現受精並獲得瞭小鼠、兔、馬、綿羊、牛和豬等正常動物。20世紀90年代以來,先後在澳大利亞、美國、比利時、加拿大、法國等國傢誕生瞭大批的試管嬰兒,從而使該技術成為治療男性不育癥的理想手段。在中國,1993年利用該技術獲得瞭4隻正常仔兔。1996年誕生瞭中國的第一例顯微受精嬰兒。

  動物轉基因技術 借助生物、物理或化學方法,將特定外源基因導入動物細胞並整合到染色體上,通過整合瞭外源基因的生殖細胞,將外源基因的遺傳特性傳遞給下一代,這種方法稱為轉基因技術,這種整合瞭外源基因的動物,稱為轉基因動物。哺乳動物轉基因技術在理論研究和應用研究方面均具有重要意義。動物轉基因技術在生命科學研究中具有廣闊的運用前景。通過轉基因技術可以研究基因的結構和功能,可以運用於優良動物品種的生產,例如把生長激素基因和生長激素釋放因子基因轉入傢畜中,可以提高動物的產肉率、產奶率、加快生長速度和繁殖速度等。還可以用於動物生物反應器研究,通過轉基因動物的乳、血等各種人類健康所必需的動物活性物質,預防和治療人類疾病。

  動物細胞核移植技術 又稱動物克隆技術。1938年德國著名的胚胎學傢H.司匹曼提出:如果能用細胞核移植的方法,將不同發育階段細胞的核移到去核的卵中,將對研究核質關系具有重要意義。在這一設想的啟發下,許多科學傢進行瞭細胞核移植的嘗試。20世紀60年代,英國學者R.佈裡吉斯T.J.金首先應用豹蛙囊胚頂部細胞通過細胞核移植技術獲得瞭豹蛙幼蟲,從而證明瞭司匹曼的設想,開創瞭細胞核移植的研究領域。中國學者童第周等對魚類胚胎細胞核移植進行瞭系統研究,並且還在不同亞科、不同科和不同目之間進行異種細胞核移植的研究,取得瞭舉世矚目的研究成果。

  隨著技術的進步,科學傢開始研究哺乳動物細胞核移植。1981年,K.伊爾曼希P.C.霍普通過直接註射法把小鼠內細胞團細胞註入合子中,然後去原核,生出瞭小鼠。1987年R.普拉塞等用牛8至16細胞胚胎的細胞作為核供體生出瞭移核牛。1988年S.L.史迪斯J.M.羅玻以兔8細胞胚胎的細胞核為供體得到瞭克隆兔。1997年L.孟勵等獲得瞭胚胎細胞核移植的克隆猴等。這些研究證明動物的早期胚胎細胞具有全能性,能夠發育生成完整的個體,不僅從技術上實現瞭復制生命的創舉,並且為核質關系理論研究提供瞭新思路。

  雖然胚胎細胞克隆研究取得瞭重大進展,但是用體細胞克隆動物一直沒有成功,高度分化的體細胞是否具有發育全能性成為生命科學界的一個難解之謎。1996年,英國科學傢將來自6歲綿羊的乳腺細胞移入去核卵母細胞後,獲得瞭世界上第一頭體細胞克隆動物——多莉羊,從而第一次證明高度分化的體細胞仍具有全能性,能夠發育成正常個體。之後,哺乳動物體細胞核移植研究蓬勃開展,相繼成功克隆瞭小鼠、牛、山羊、兔等動物,使該研究進入一個新階段,成為舉世矚目的研究熱點。中國科學傢陳大元等於2002年首次獲得瞭克隆牛群體,使中國在體細胞核移植研究方面走在瞭世界前列。在此基礎上,陳大元等以大熊貓體細胞為核供體,兔卵母細胞為受體開展瞭異種克隆研究,首次證明兔卵母細胞能夠支持大熊貓體細胞發育到囊胚,並且還證明該異種重構胚能在傢貓體內完成著床,從而使克隆大熊貓研究更進一步。核移植技術基本程序包括:供體細胞準備、受體卵母細胞準備、細胞核移植、融合、激活、重組胚體外培養及胚胎移植等過程。但無論是胚胎細胞核移植還是體細胞核移植,都存在效率低下的問題。具體表現在克隆動物的妊娠率低、流產率較高和出生後死亡率較高等方面。科學傢正在對制約克隆動物成功率的機理進行大量研究,但尚未找到解決辦法。

  胚胎幹細胎技術 胚胎幹細胞是從早期胚胎的內細胞團分離出來的多潛能細胞,具有發育全能性,在適當條件下能發育生成動物體的所有組織和細胞,在飼養層上或白血病抑制因子存在的條件下,能夠維持未分化狀態。早在1981年,M.J.伊凡斯和M.H.考夫曼就成功分離瞭小鼠的胚胎幹細胞,中國也有不少科研機構從事胚胎幹細胞研究,並已獲得明顯進展。1998年J.A.湯姆遜等成功從人囊胚中分離獲得瞭人胚胎幹細胞,使胚胎幹細胞研究成為當今社會關註的焦點。胚胎幹細胞具有發育全能性,可以根據需要使其定向誘導分化為特定的組織和細胞,如神經組織、肌肉組織等。因此胚胎幹細胞技術可能為移植醫學提供細胞來源,對於人類疑難疾病的治療具有重要意義。

  把胚胎幹細胞技術和體細胞核移植技術相結合,將對人類社會,尤其是人類疾病的治療產生革命性影響。把患有某種疾病病人的體細胞培養,作為供核體,註入去核卵母細胞中,從發育到囊胚的重組胚中就可以分離到病人的胚胎幹細胞。利用胚胎幹細胞的發育全能性,在適當條件下經定向誘導,就能分化成人的各種組織。由於該幹細胞來源於患者本身,因此就避免器官移植中難以克服的免疫排斥和組織器官來源短缺的問題,而使病人得到徹底的治愈。故此技術的發展和完善必將使人類疾病的治療更加有效,大大造福於人類社會。

  展望 從顯微技術的發展趨勢看,在以下方面將有較大進展:①技術上將向定量顯微術方向發展;②在操作上將向更高的自動化操作發展;③設法解決在超微結構水平上對活體的觀察;④進一步提高動物克隆技術的效率,並逐步揭示影響克隆動物效率的機理;⑤胚胎幹細胞定向分化技術進一步完善,使“治療性克隆”真正應用於人類疾病的治療;⑥轉基因動物技術更加有效,進一步提高生物活性物質的表達水平。