簡稱限制性核酸酶。這是一類能從DNA分子中間水解磷酸二酯鍵，從而切斷雙鏈DNA的核酸水解酶。它們不同於一般的去氧核糖核酸酶（DNase），它們的切點大多很嚴格，要求專一的核苷酸順序──識別順序。長期以來，難以深入研究的DNA大分子，借此可以切割成特定的小片段來分析。限制性核酸酶的發現，為基因結構、DNA堿基順序分析和基因工程的研究開闢瞭途徑。為此，W.阿爾伯，H.史密斯和D.南森斯三人共同獲得瞭1978年諾貝爾生理學或醫學獎。
<限制性核酸酶在原核和真核細胞中都有發現，按其性質可分為三大類。所謂Ⅰ型的酶要求DNA分子上有特定的識別順序，但是切點卻不在此識別順序之中，而與之有一定距離。在反應中，它還要求有ATP和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。酶由不同的α，β，γ亞基組成。全酶兼有限制性內切酶的活性和甲基化酶的活性。Ⅲ型的酶與Ⅰ型的酶有相似特征，隻是切點距識別順序距離是嚴格的。
Ⅱ型的酶，可說是獨立的限制性核酸內切酶。因為，它並不兼有甲基化酶的活性。細胞內可另有獨立的甲基化酶。它切斷DNA時不需ATP，也不需SAM。它的切點是嚴格的，而且就在識別順序之中。Ⅱ型的酶在蛋白質組成上比Ⅰ型、Ⅲ型要簡單的多，它隻有單一的亞基。以二體或四體發揮作用。
至1988年，從細菌中發現的Ⅱ型的限制性核酸酶已有約850種：下面對Ⅱ型酶作進一步的介紹。常用的限制性核酸酶有EcoRⅠ，HindⅢ，AluⅠ，HaeⅢ等，其命名都以菌種名的第一個字母的大寫字母起頭，以菌種屬名的字首二個小寫字母繼後。必要時加上菌株的標志字母，如EcoRⅠ之R或HindⅢ之d。最後，若由此菌株可以得到的限制性核酸酶不止一種，則按Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ編號。如：
EcoRⅠ 來自 Escherichia coliRY13之酶Ⅰ
HindⅢ 來自 Haemophilius influenzaeRd之酶Ⅲ
AluⅠ 來自 Arthrobacter luteus之酶Ⅰ
HaeⅢ 來自 Haemophilus aegyptius之酶Ⅲ
這些酶的識別順序多數是4或6個堿基對。有的酶要5或7個甚至更長的識別順序。識別順序短的在DNA分子上出現的幾率多，酶可把DNA分子切成較多的小片段。識別順序長的則往往隻切出少數大片段。這些酶切片段統稱為限制性片段。根據不同限制性核酸酶在某DNA分子上的切點分佈，可以繪出該DNA分子的“限制性圖譜”即“酶切圖譜”，也稱“物理圖譜”。限制性圖譜可以反映出一個DNA片段或基因結構的基本特征。
這些酶的識別順序大都具有180°旋轉對稱的特征。切點絕大多數都在識別順序之內。切口有時是平頭的，即雙鏈的切點位置相同。如AluⅠ和HaeⅢ。有時切口可帶有一個短的單鏈末端，如EcoRⅠ和HindⅢ。
這種短的單鏈末端，稱為“粘性末端”。它與對應的單鏈末端很容易恢復原來的堿基配對，而粘接成雙鏈。這個過程稱為“退火”。通過粘性末端使DNA片段相互連接，非常準確方便，在基因工程中十分有用。
限制性核酸酶的鑒定，常用一些純的病毒DNA作為標準底物，觀察其酶切片段在凝膠電泳中所出現的條帶。最常用的標準DNA是λ噬菌體的DNA。