核磁共振

　　是磁矩不為零的原子核，在外磁場作用下自旋能級發生蔡曼分裂，共振吸收某一定頻率的射頻輻射的物理過程。核磁共振波譜學是光譜學的一個分支，其共振頻率在射頻波段，相應的躍遷是核自旋在核蔡曼能級上的躍遷。

　　基本原理　自旋量子數I不為零的核與外磁場H₀相互作用，，使核能級發生2I+1重分裂，此為蔡曼分裂。核自旋在蔡曼能級之間躍遷的選擇定則為

， m為核磁量子數。可發生核自旋躍遷的兩能級的能量之差

其中 υ為旋磁比， ＝ h/2π， h為普朗克常數。

　　如果在上述靜磁場H₀存在的同時再加上一個方向與之垂直，強度遠小於H₀的射頻交變磁場H₁，並且其頻率

滿足如下條件：

　　則原子核會吸收射頻場能量，在兩蔡曼能級之間發生躍遷，此現象為核磁共振現象。共振圓頻率：

　　核磁共振頻率因核而異，對於同一種核，共振頻率與靜磁場H₀成正比。

核磁共振光譜中常用原子核的性質

　　主要參數　化學位移　同一種核在分子中因所處的化學環境不同，使共振頻率發生位移的現象。

　　化學位移產生的原因是分子中運動的電子在外磁場下對核產生的磁屏蔽。屏蔽作用的大小可用屏蔽因子σ來表示。一般來說屏蔽因子σ是一個二階張量，隻有在液體中由於分子的快速翻滾，化學位移的各向異性被平均，屏蔽因子才表現為一常量。

　　核磁共振的共振頻率：

　　實際測定中化學位移是以某一參考物的譜線為標準，其他譜線都與它比較，即以一無因次的量δ表示化學位移的大小。常用參考物是四甲基矽(TMS)。

　　H_參考，H_樣品分別是使參考物和被測樣品共振的磁場強度，H₀是儀器工作的磁場強度。

　　v_參考，v_樣品分別是參考物和被測樣品的共振頻率，υ₀是儀器的工作頻率，化學位移的單位是(ppm百萬分之一)。

　　由圖1可見，

H， C _βH及芳環上的質子的化學位移各異。其他核(如 ¹³C， ¹⁹F， ³¹P等)的核磁吸收峰也因基團各異而有不同的化學位移值。即使同類殘基的同一基團，因生物分子的特定構象而有不同化學環境，亦可有不同化學位移值。基於這點，人們可逐一識別各譜峰代表什麼基團，因此NMR可廣泛用於分子生物學，生物物理學以至生物醫學研究。

　　化學位移的大小受鄰近基團的電負性、磁各向異性、芳環環流、溶劑、pH值、氫鍵等許多因素的影響。其中有3種效應常被用於生物學研究。①環流效應：生物分子中常有含大π共軛電子雲的芳環或芳雜環，如Phe、His、Tyr、Trp、嘌呤、嘧啶以及卟啉環。原子核相對於這些環的距離，方位不同，受大π電子雲產生的附加磁場的影響不同，對各核化學位移的影響亦不同。環流效應常用於生物分子的溶液構象研究。②順磁效應：弤、Fe²⁺(高自旋態)、CO²⁺、Mn²⁺等順磁離子及有機自由基（自旋標記化合物）中的不成對電子對周圍核的化學位移及弛豫過程會有很大的影響，利用這個效應可研究順磁離子周圍基團的狀況。③pH滴定效應：在不同pH條件下，各解離基團的解離狀況不一，造成附近基團有不同的化學環境，從而使得化學位移隨pH變化。

　　耦合常數　核與核之間以價電子為媒介相互耦合引起譜線分裂的現象稱為自旋裂分。由於自旋裂分形成的多重峰中相鄰兩峰之間的距離被稱為自旋－自旋耦合常數，用J表示。耦合常數用來表征兩核之間耦合作用的大小，具有頻率的因次，單位是赫茲。

　　一般來說由於自旋耦合使高分辨核磁共振波譜變得十分復雜，但是當化學位移之差Δγ遠大於耦合常數時，一個含有n個自旋量子數為I的核的基團將會使其鄰近基團中核的吸收峰分裂為2nI+1重峰，並且這2nI+1重峰的強度分佈服從二項式系數分配公式(1+x)ⁿ。此為一級分裂波譜。

　　圖1中各峰由於自旋耦合而產生譜線裂分。耦合常數的大小與外加磁場的大小無關，與分子結構有關即與兩核之間鍵的數目及電子雲的分佈有關。一般來說，兩核之間相隔3個以上的化學鍵之間的耦合被稱為遠程耦合，J值很小。如果兩核之間相隔四個或四個以上的單鍵，J值基本上等於零。

　　耦合常數可提供分子中二面角的信息。多肽和蛋白質中NH-

H耦合常數和圍繞 -N 鍵的二面角 之間有如下的Karplus關系式

　　核苷酸的某些構象信息，亦可按一定公式由耦合常數測知。

　　譜峰強度　吸收峰下的面積，即吸收峰積分曲線的高度與產生該吸收峰基團的粒子數成正比。圖1中苯環間位質子峰，苯環鄰位質子峰，α-CH質子峰，β-C_H2質子峰的積分強度之比為2∶2∶1∶2。

　　弛豫參數　①自旋-晶格弛豫時間（縱向弛豫時間）T₁，核系統與周圍晶格相互作用，交換能量，使核系統恢復平衡，這一過程被稱為自旋－晶格弛豫過程，自旋－晶格弛豫過程的快慢可用自旋－晶格弛豫時間T₁來表征。T₁的單位是秒。②自旋－自旋弛豫時間(橫向弛豫時間)T₂，等同核之間的磁相作用被稱為自旋－自旋相互作用。等同核之間相互交換自旋態並不改變系統的總能量，卻縮短瞭系統在激發態的能級壽命。自旋－自旋弛豫時間T₂是核處於激發態的能級壽命，以秒為單位，它與譜線寬度有關。

Δγ為譜峰半高寬(Hz)。③核奧弗豪澤效應。當一個強的射頻場加到一組核上，使其中一個或多個躍遷被飽和，這時在空間相鄰近的另一組核的共振信號的積分強度會因此而改變，這一現象被稱為核奧弗豪澤效應，最早由A.W.奧弗豪澤發現。

　　核奧弗豪澤效應的大小可用NOE來表示：

I₀是未照射時信號強度，I_z是鄰近基團被照射時的信號強度，η被稱為核奧弗豪澤效應增強因子。

　　T₁、T₂、NOE都與分子運動的相關時間τ₀有關，從中可以得到生物大分子內部動力學的信息，NOE還與兩核之間距離的6次方成反比。

　　核磁共振譜儀　分為兩大類，即連續譜核磁共振譜儀及脈沖傅立葉變換核磁共振譜儀。前者將單一頻率的射頻場連續加在核系統上，得到的是頻率域上的吸收信號和色散信號。後者將短而強的等距脈沖所調制的射頻信號加到核系統上，使不同共振頻率的許多核同時得到激發，得到的是時間域上的自由感應衰減信號(FID)的相幹圖，再經過計算機進行快速傅立葉變換後才得到頻率域上的信號。

　　歷史發展　1946年美國斯坦福F.佈洛克和美國哈佛大學E.M.珀塞耳小組幾乎同時記錄到液體樣品和固體樣品中的核磁共振信號。核磁共振波譜技術用於生物學問題始於50年代中，首次成功地用核磁共振波譜直接觀察到生物大分子的是桑德斯和J.G.柯克伍德，他們於1957年報告瞭40MHz的核糖核酸酶的¹H核磁共振波譜。同年O.雅德茨基和C.D.雅德茨基也證明核磁共振波譜可以精確地反映蛋白質的氨基酸組成。到目前為止，生物體中蛋白質、核酸、磷脂、多糖及其相應組分均可用 NMR技術研究，核磁共振波譜已成為在溶液態研究生物高分子空間結構與功能的最重要物理手段。

　　在生物學中的應用　核磁共振波譜技術用來研究生物大分子有如下特點：

　　①不破壞生物高分子結構（包括空間結構）。

　　②在溶液中測定符合生物體的常態，也可測定固體樣品，比較晶態和溶液態的構象異同。

　　③不僅可用來研究構象而且可用來研究構象變化即動力學過程。

　　④可以提供分子中個別基團的信息，對於比較小的多肽和蛋白質已可通過二維NMR獲得全部三維結構信息。

　　⑤可用來研究活細胞和活組織。

　　在生物學研究中最常用的是¹H，¹³C，³¹P譜，此外還有¹⁵N，¹⁹F等。¹H譜發展最早，¹H在生物體中無所不在，核磁相對靈敏度高，故應用最廣，包括用於核磁成像。缺點是含氫基團極多，譜線易重疊而不易解析。碳亦為生物體內重要元素，但¹²C自旋為零，¹³C天然豐度低，僅為1.1％，對等數量的核在相同磁場下其靈敏度隻及¹H的1.6％。其優點是化學位移范圍寬，在寬帶去耦條件下進行實驗，波譜簡單，易分辨，隨著測定技術及¹³C標記方法的發展，¹³C 譜已有極廣泛的應用。³¹P譜常用於活組織測定，觀察ATP等含磷化合物的代謝過程，並已用於核磁成像。

　　NMR在生物學研究中范圍很廣。主要有：

　　分析研究　如確定生物分子成分及濃度，特別是可不破壞組織細胞而測知其中組分；確定異構體比例；確定分子解離狀態；確定金屬離子或配基是否處於結合狀態；以及測定細胞膜內外的pH差異。

　　熱力學研究　如測定酶與底物、配基、抑制劑的結合常數；測定可解離基團的pK值，特別是能測定生物大分子中分處不同微環境的同類殘基的同類基團的不同pK值，這是其他方法所不及的；還可測定相變溫度，ΔG等其他熱力學參數。

　　動力學研究　如監測反應進程，測定各組分隨時間的變化；通過變溫實驗和線形分析，測平衡過程的動力學常數，包括某些生化反應的反應速率，研究分子間（如酶與抑制劑，DNA與藥物）相互作用的動力學過程。

　　分子運動研究　弛豫參數(T₁，T₂，NOE)可用來研究生物高分子的動力學，以及生物膜的流動性。

　　分子構象及構象變化研究　目前用二維核磁共振技術加上計算機模擬已能獨立確定小的蛋白質分子及核苷酸片段在溶液中的三維空間結構。改變物理化學因素或加入可與生物分子相互作用的其他物質，將會使核磁圖譜發生變化，從而可用來研究這種構象變化。

　　活體研究　用³¹P，¹³C，¹H磁共振方法測定活細胞，活組織以致整體的代謝物濃度及變化，測定細胞內pH值，觀察藥物或不同生理狀況對代謝的影響。研究對象有微生物、植物、各種動物以至人體器官等。

　　二維核磁共振譜　自70年代末，特別是80年代以來二維核磁共振(2D-NMR)及核磁成像技術(NMRimage)迅速發展，已在生物學、醫學研究中發揮越來越大的作用。

　　二維核磁共振的思想是1971年提出的，1976年R.R.恩斯特用密度矩陣方法對二維核磁共振實驗進行瞭詳細的理論闡述，自此二維核磁共振技術得到瞭非常迅猛的發展。1977年K.維特裡希首先將此方法用於生物高分子，研究氨基酸和牛胰胰蛋白酶抑制劑，在此基礎上發展瞭用二維核磁共振對蛋白質¹H-NMR的單個譜峰全部識別的方法。

　　二維核磁共振譜S(ω₁，ω₂)被定義為二個獨立的頻率變量ω₁和ω₂的函數，它是由對時間域上的函數S(t₁，t₂）進行二維傅立葉變換得到的。

　　其基本原理如下：所有二維核磁共振波譜在時間域上都可分為四個時期，即準備期、發展期、混和期（可以沒有）及檢測期，其中發展期的時間間隔為t₁，檢測期的時間間隔為t₂。

　　準備期一般比較長，自旋系統在這一時期達到熱平衡。發展期加上一個或多個射頻脈沖使核系統演化。混和期包括脈沖和延遲時間。在檢測期，信號作為t₂的函數被檢測，並以發展期的時間間隔t₁為參數。隻改變發展期的時間間隔t₁，重復多次實驗，即可得到時間域的二維信號S（t₁，t₂），對此作二維傅立葉變換即得頻率域的二維核磁共振譜S（ω₁，ω₂）。二維核磁共振譜可分為3類：

　　化學位移相關譜　這類實驗可以將相互耦合的核或者具有化學交換的核，或是有交互弛豫的核的化學位移相關聯。

　　J－譜　在J（耦合分解）譜中，決定共振峰位置的兩個參數，即標量耦合和化學位移得到分開。

　　多量子譜　這類實驗可用來檢測多量子躍遷。K.維特裡希將2D-NMR用於蛋白質結構研究，使得人們有可能對小的或中等大小的蛋白質，無需晶體結構資料，隻根據一級結構序列和一套 NMR數據就可以推斷該蛋白質在溶液中的構象。

　　對肽鏈中各基團的質子而言，存在兩種相互關系，一種是通過化學鍵的J耦合關系，一種是通過空間的NOE關系（圖2）。蛋白質中上述兩種相互關系可以通過二類2D-NMR實驗找出：

　　①二維相關譜(COSY)　如圖3所示，對角線上的峰是一維譜峰，對角線以外的峰為交叉峰，交叉峰相對於對角線為軸對稱，從一個交叉峰出發分別作垂直線與水平線與對角線相交，相交處的兩峰所對應的核之間有 J耦合。因此交叉峰將標量耦合的質子相關聯。

　　②二維核奧弗豪澤增強譜(NOESY)　如圖4所示，其交叉峰將空間上比較接近，相互之間有NOE的峰相關聯，這包括同一氨基酸殘基中由共價鍵相連的質子如 C_αH，C_βH，C_γH，在氨基酸序列中相鄰殘基之間主鏈上的質子，如C

H和 N ^{i+1 1}H，以及在一級結構序列中分開較遠而在三維空間結構上接近的質子。實際工作中將半張COSY譜，半張NOESY譜按對角線並接成圖即可沿肽鏈按殘基序列逐一識別出共振峰。此外NOESY譜還可提供 ¹H和 ¹H之間空間距離的信息，從而得到有關蛋白質二級結構的信息。

　　2D－NMR　目前已不僅被用來研究蛋白質，而且用來研究核酸以及蛋白質和核酸的相互作用。

　　核磁成像技術(NMR image)　與X射線斷層成像(CT)相似，但其物理過程則完全不同。CT成像靠不同組織對X射線的吸收差異而成像；核磁成像則是因不同組織的自旋密度(¹H或³¹P)或弛豫參數（T₁或T₂）不同而成像。核磁成像技術的基本原理是根據非均勻磁場造成的譜線的非均勻加寬中包含有核自旋空間位置和它們的分子環境的信息。若在靜磁場H₀上再疊加一個線性磁場梯度G，則隻有位於垂直於G的同一平面中的質子才受到相同的磁場，即具有相同的共振頻率，其強度正比於核平面中核自旋數，不同平面中質子共振頻率不同，強度也不同，從而使譜線非均勻地加寬，這種加寬瞭的共振峰實際上就是樣品中核自旋密度在G方向上的投影。改變磁場梯度的方向即可得一系列共振吸收譜，用計算機進行圖象重構，則可得到被測物體在某一平面上的投影圖。除上述投影重建法外，近年來還發展瞭敏感點掃描法，選擇性激發法及場聚焦法等成象方法。NMR 圖象除瞭給出質子或其他一些核的自旋密度的空間信息外還能得到弛豫時間的空間信息。目前核磁成像已用於臨床診斷，其優點是對軟組織敏感，無X射線損傷，不僅能顯示形態結構，還可提供不同組織的生理、化學特性，可以自由選擇剖面。

　　

參考書目

　O.Jardetzky，N M R in Molecular Biology，Academic Press，New York，1981.

　K.Wüthrich，N M R in Biological Research Peptides and Proteins，North Holland Amsterdam，Biomedical Press，1976.

　L.J.Berliner，J.Reuben eds，Biological Magnetic Resonance，Vo1.4，Plenum Press，New York，1980.