利用單色光對準一種同位素的譜線位置，將它光解離或激勵至激發態進行反應，而其餘同位素不被光解或激發而存留於原來物料中，達到同位素分離的目的。
同一元素的不同同位素在原子光譜和分子光譜上都存在位移效應。例如原子光譜中，最大的同位素位移是半重氫的938埃線，ΔvHD＝31.2 釐米-1，最小的的是69Ga和71Ga的4033埃線，Δv＝0.0006厘米-1，而鈾的4246.3埃線，Δv＝0.28 厘米-1。分子振動譜帶的同位素位移則是同位素的折合質量上或分子的中心原子和整個分子質量上的差異造成的。例如HF和DF在4000厘米-1處的位移約1100厘米-1，32SF6和33SF6在939厘米-1處位移8厘米-1，235UF6和238UF6在628厘米-1處的位移約0.65厘米-1。
在發現同位素和同位素光譜效應後不久，這種用光化學選擇分離同位素的方案在1920年由T.R.默頓設想出來，隨後的20多年內，曾用窄譜帶光源進行瞭氯同位素和汞同位素的光化學分離。但由於光源不理想，分離效果不佳。
60年代初，出現瞭激光。由於激光的單色性、高強度和短脈寬等優異性能，自然地成為同位素分離的理想光源。1966年，W.B.蒂法尼、H.W.莫斯和A.L.沙勞首次用激光進行瞭分離同位素的嘗試。1970年，S.W.邁耶等首次用氟化氫氣體激光器分離氫同位素成功之後，最近十多年來，已在實驗室中，用激光方法成功地分離瞭氫、硼、氮、碳、氯、硫、鈉、鋰、溴、鈣、鋇、鋨、鈾等同位素。其中氫-氘同位素的分離系數高達10000以上，12C-13C的分離系數也達到600左右，都遠遠超過其他同位素分離方法，顯示瞭激光分離法的明顯優勢。目前，硫、碳、鈾同位素的激光分離，都已達到相當的規模。而意義最大、難度最高的是激光分離 235U-238U同位素。目前，激光分離鈾同位素主要有兩種方法：原子法和分子法。
① 原子法是將金屬鈾在高溫(約2500K)下加熱氣化成鈾蒸氣。用銅蒸氣泵浦的三臺染料激光器，以三種不同波長的激光，選擇性地將235U進行三步光電離。電離瞭的235U原子，由電磁場收集成為濃縮產物，而中性的238U原子，則穿過磁場作為尾氣收集。鈾原子的電離能約6電子伏，光譜復雜，已發表的鈾原子和離子的常規光譜約四萬多條譜線。必須精選三條作為三步光電離的激光波長。一般采用5915.4埃作為第一步激發的激光波長。
② 分子法是將235UF6和238UF6混合物經超音速膨脹來降低氣體溫度（約40K）並簡化它的吸收光譜，然後用紅外激光選擇性地將235UF6激發到激勵激發態，繼而將它激發解離出氟原子而產生細粉狀濃縮的235UF5，達到鈾同位素分離目的。UF6分子光譜也很復雜，也必須精選分離所需的激光波長。分離所用的精調激光器也不夠成熟。目前已發表的第一步激發的激光頻率為628.33厘米-1。