也稱定組成定律。其內容為：一種化合物，不論是天然存在的還是人工合成的，不論是用哪種方法製備的，它的化學組成總是確定的，例如，二氧化碳分子中碳和氧的品質比總是3：8，或者說它的組成總是含碳27％、含氧73％。因為二氧化碳分子由1個碳原子和兩個氧原子組成，它的分子式是CO2，碳和氧的原子量都是定值，所以二氧化碳中碳、氧品質比總是確定的。
“一種化合物的的組成是不是一定的?”這個問題在18和19世紀之交曾有過激烈的爭論，以C.-L.貝托萊為代表的一派主張，化合物的組成可隨制備條件而異；而以J.-L.普魯斯特為代表的一派則主張，純化合物中各元素的質量比是確定的。普魯斯特和其他許多化學傢以大量實驗數據論證瞭定比定律，J.道爾頓根椐這些事實提出瞭原子論，從此定比定律得到瞭化學傢的普遍承認。
隨著科學的發展，現在對化合物的定義已有所擴大。有一些化合物的組成在小范圍內是可以改變的。例如γ黃銅的理想組成(符合定比定律)是Cu5·Zn8，相當於含62％的Zn，事實上γ黃銅的含鋅量可在59％～67％連續變化。這是因為晶格點上一些銅原子為鋅原子所置換，或鋅原子為銅原子所置換。現在把這類化合物叫非化學計量化合物，而把符合定比定律的叫化學計量化合物。