哺乳動物乳汁中的雙糖，由D-半乳糖和D-葡萄糖通過β(1-4)糖苷鍵聯接而成。乳糖分子中的葡萄糖組份保留瞭還原性的半縮醛羥基，因此乳糖具有還原性。一般情況下獲得的乳糖晶體為α-D型，93.5℃以上析出的晶體則為β-D型。
哺乳動物僅在泌乳期，才在乳腺中合成乳糖，乳汁中乳糖含量約為2～6％。人乳中乳糖含量是牛乳的兩倍。
動物泌乳時，乳汁中的乳糖合成酶，催化尿嘧啶核苷二磷酸半乳糖(UDPGal)和D-葡萄糖反應生成乳糖。合成酶由A和B二種亞基組成，單獨的A或B亞基毫無催化作用，重組之後即表現合成酶的活性。現已證明，A亞基具有UDP-Gal轉移酶的活性，而B亞基就是α-乳清蛋白，後者的作用是調節A亞基轉移酶的專一性，使其有利於合成。
人腸道中有乳糖酶，可將乳糖分解為葡萄糖和半乳糖而吸收利用。一般說來，初生嬰兒腸道中乳糖酶活性甚高，2～5歲後酶活性逐漸降低，成年時已降到很低。歐洲人種的成年人具有較高乳糖酶活性。成年人腸道中乳糖酶的缺失稱乳糖酶缺失癥，在嬰兒則稱為乳糖不耐受癥。患者不能消化吸收乳汁中的乳糖，表現出不同程度的腹瀉。如果從食物中除去乳糖可使癥狀消失。
乳糖消化吸收後產生的大量半乳糖，在人體內需經過酶促轉化為葡萄糖的衍生物才能被進一步代謝利用。極少數嬰兒先天缺失有關的酶，導致半乳糖不能轉化為葡萄糖的衍生物在體內大量積累造成危害，稱為半乳糖血癥，表現出生長停頓，智力呆滯等癥狀。患有半乳糖血癥的嬰兒如果喂以去乳糖膳食，也可正常長大成人。
一些細菌也具有利用乳糖的能力。通過對大腸桿菌利用乳糖的機理的研究，揭示的乳糖操縱子，是分子生物學的一項重要成就（見基因調控）。
工業上，一般從牛乳乳清制備乳糖。食品工業中酸奶的制備，主要是利用嗜酸乳桿菌發酵乳糖產生乳酸，構成酸奶的主要酸味成分。