一類能從DNA分子中間水解磷酸二酯鍵，從而切斷雙鏈DNA的核酸水解酶。簡稱限制性核酸酶、限制性酶。它們不同於一般的去氧核糖核酸酶(DNase)，它們的切點大多很嚴格，要求專一的核苷酸順序——識別順序。長期以來，難以深入研究的DNA大分子，借此可以切割成特定的小片段進行分析。限制性核酸酶的發現，為基因結構、DNA堿基順序分析和基因工程的研究開闢瞭途徑。為此，W.阿爾伯、H.O.史密斯和D.南森斯三人共同獲得得瞭1978年諾貝爾生理學或醫學獎。
限制性核酸酶在原核和真核細胞中都有發現，主要有三大類。其酶切反應都需Mg2＋，酶切專一性都要求DNA分子上有其特異的識別順序。Ⅰ型和Ⅲ型酶反應中還需ATP和S–腺苷甲硫氨酸，它們兼有限制性內切酶的活性和甲基化酶的活性。Ⅰ型酶的全酶由α、β、γ不同亞基組成。酶的切點不很嚴格，距離其識別順序在1kb以上。Ⅲ型酶的全酶包括兩個不同的亞基，反應條件與Ⅰ型相同，但切點嚴格在識別順序3′端外24–26bp。Ⅰ型和Ⅲ型酶在基因工程用處不大。
Ⅱ型的限制性內切酶是重要的基因工程工具酶，它隻有單一的亞基，以二體或四體起作用，反應中也需有Mg2＋，但不需ATP和S–腺苷甲硫氨酸，不兼有甲基化酶的作用。
至2003年已發現的Ⅱ型限制性內切酶近4 000種，有商品供應的已達500餘種，而最常用的不過百種。酶的命名都以菌種名的第一個字母的大寫字母起頭，以菌種屬名的前兩個小寫字母繼後。必要時加上菌株的標志字母，如：EcoRⅠ之R或HindⅢ之d。最後，若由此菌株可以得到的限制性核酸酶不止一種，則按Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ編號。如：
EcoRⅠ 來自 Escherichia coli RY13之酶Ⅰ
Hind Ⅲ 來自 Haemophilius influenzae Rd之酶Ⅲ
AluⅠ 來自 Arthrobacter luteus之酶Ⅰ
HaeⅢ 來自 Haemophilus aegyptius之酶Ⅲ
這些酶的識別順序絕大多數是4或6個堿基對。有的酶要5或7個甚至更長的識別順序。識別順序短的在DNA分子上出現的概率多，酶可把DNA分子切成較多的小片段。識別順序長的則往往隻切出少數大片段。這些酶切片段統稱為限制性片段。根據不同限制性核酸酶在某DNA分子上的切點分佈，可以繪出該DNA分子的“限制性圖譜”即“酶切圖譜”，也稱“物理圖譜”。限制性圖譜可以反映出一個DNA片段或基因結構的基本特征，是基因組測序核查的一個重要方法。
Ⅱ型限制性內切酶的識別順序大都具有180°旋轉對稱的特征，稱為“回文結構”。切點絕大多數都在識別順序之內。在雙鏈上的切點位置若相同，如AluⅠ和Hae Ⅲ，則產生“平頭末端”。若切點在雙鏈的位置不同，如EcoRⅠ和HindⅢ，則產生兩個短的單鏈末端，稱為“黏性末端”。因為對應的單鏈末端之間很容易恢復原來的堿基配對，黏合成雙鏈，這個過程稱為“退火”。通過黏性末端使DNA片段相互連接，非常準確方便，在基因工程中十分有用。
現在發現的Ⅱ型酶中，有一些酶具有相同的識別順序、相同的切點、產生相同的末端，這些酶稱為“同裂酶”。有些識別順序中含有CpG的同裂酶會對5–甲基化C的敏感性不同。HpaⅡ隻切C↓CGG，不切Cm5CGG，常用於檢測DNA的甲基化。而MspⅠ則對二者可同樣切割。植物DNA甲基化程度很高，常需選用對甲基化不敏感的同裂酶。
另外，有些Ⅱ型酶的識別順序，雖不完全相同，但可切出相同的黏性末端，而被稱為“同尾酶”。例如：常用的BamHI(G↓GATCC)與Sau3A1(↓GATC)都可產生相同的單鏈黏性末端，可方便地進行末端連接。
限制性核酸酶的鑒定，常用一些純的病毒DNA作為標準底物，觀察其酶切片段在凝膠電泳中所出現的條帶。最常用的標準DNA是λ噬菌體的DNA。