利用可見光(380~760納米波長)照明,使微小物體放大成像的儀器。這種放大像可用肉眼觀察、攝影或用光電管以及其他接受器進行探測。(見彩圖)
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基本結構 可分為簡單和復式兩種類型。簡單顯微鏡即放大鏡,由正透鏡組成,放置於物體和肉眼之間,使微小物體放大成虛像。復式顯微鏡由兩組透鏡或透鏡系統組成。第一組透鏡(即物鏡)形成物體的放大像,第二組透鏡(即目鏡)放大第一組透鏡形成的像。典型的復式光學顯微鏡由支架、反光鏡、聚光鏡、載物臺、鏡筒、物鏡、目鏡、以及調節鏡筒或載物臺移動的機械裝置組成(圖1)。
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性能 除瞭能放大物體外,還應具有良好的分辯力以及形成好的反差像。
分辨力 指能夠分辨出兩個相距最近的物點的能力。可由下式表示:
兩物點的最小分辨距離=K
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反差 表明樣品各部分之間以及它們與背景之間光亮度的差別。在一般明視場顯微鏡中,樣品各部分對光的吸收不同,這是造成反差的主要原因。此外,樣品表面上的散射對形成反差也很重要。在適當的情況下,縮小聚光鏡的孔徑光闌雖會減小顯微鏡的分辨力,但增強瞭反差,反而會使圖像更清晰可辨。許多特殊顯微鏡正是基於增強樣品的反差設計的。
透鏡的像差 除瞭分辨力的限制以外,透鏡本身存在著一系列缺陷,影響顯微鏡成像的質量。這些缺陷名為像差,包括由於透鏡邊緣和中央部分的折射不同造成的球差;由於不同波長的光線折射率不同造成的色差以及場曲等。用組合透鏡可以糾正一定程度的像差。
主要部件與功能 物鏡 其作用是形成第一級像。在物鏡上一般都標出數值孔徑、放大率、焦距長度和工作距離等有關數值。一般對物鏡的球差都進行瞭校正;對兩種顏色(藍和紅)色差進行瞭校正的物鏡稱為消色差物鏡,校正3種顏色(藍、綠和紅)色差的稱為復消色差物鏡,居於二者之間的稱為半-復消色差物鏡。平場物鏡糾正瞭場曲,適用於顯微攝影。浸液物鏡(浸油、水或其他化合物)可以增加數值孔徑,提高物鏡的分辨力。熒光顯微鏡中常用40倍或60倍數值孔徑為1.30的浸液物鏡,以增強收集熒光的能力。通常的物鏡適用於0.17毫米厚度的蓋玻片,但實際上蓋玻片的厚度變動於0.15~0.22毫米之間,易造成像差,因而有些物鏡上裝置瞭“校正環”用來補償蓋玻片厚度的變化。
目鏡 用於放大物鏡形成的中間像,也用於校正中間像中的殘餘像差。
目鏡有5~20倍的放大倍數。惠更斯目鏡是最常用的一種目鏡。補償目鏡是與復消色差物鏡組合使用的,以補償復消色差物鏡的放大率色差。為瞭保持最小畸變的平面場,設計瞭投影或攝影目鏡,用於顯微投影或攝影。長出瞳目鏡適用於戴眼鏡者觀看。廣視場目鏡可觀察到較大的現場。
鏡筒 分為單目、雙目、三目3種。三目鏡筒的兩個目鏡用於觀察,另一個用於顯微攝影、投影或測量。
聚光鏡和照明 聚光鏡用於集中從光源來的光線,使被觀察的標本得到更明亮和均勻的照明。常用的有阿貝聚光鏡,由兩個透鏡組成,數值孔徑為1.30,通常帶有球差和色差。多透鏡的聚光鏡可校正這些誤差,其數值孔徑可達1.40。正確使用聚光鏡系統對於發揮顯微鏡的分辨力和增強像的反差有很大的影響。常用的照明系統有兩種,一為臨界照明,使光源聚焦在樣品平面上;另一種為柯勒照明,即通過燈室透鏡在聚光鏡孔徑光闌上形成光源的像,此外在標本平面上形成視場光闌的像。柯勒照相能得到均勻的照明,並得到好的反差像。照明可用日光或人工光。
幾種特殊類型的光學顯微鏡 暗視場顯微鏡 使用特殊的暗視場聚光鏡使照明光線偏移而不進入物鏡,隻有樣品的散射光進入物鏡。因而在暗背景上得到亮的像(圖2c),與暗視場照明相反,照明的光線直接到達成像平面的,稱明視場照明。
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暗視場顯微鏡主要用於觀察結構和折射率變化有關的物體,如矽藻、放射蟲類、細菌等具有規律結構的單細胞生物以及細胞中的線狀結構,如鞭毛、纖維等。用暗視場顯微鏡還可觀察到物鏡分辨極限以下的質點,但不適用於觀察染色的標本。
相差顯微鏡 利用物體不同結構成分之間的折射率和厚度的差別,把通過物體不同部分的光程差轉變為振幅(光強度)的差別(圖2b),經過帶有環狀光闌的聚光鏡和帶有相位片的相差物鏡實現觀測的顯微鏡。主要用於觀察活細胞或不染色的組織切片,有時也可用於觀察缺少反差的染色樣品。
幹涉顯微鏡 采用通過樣品內和樣品外的相幹光束產生幹涉的方法,把相位差(或光程差)轉換為振幅(光強度)變化的顯微鏡,根據幹涉圖形可分辨出樣品中的結構(圖2f),並可測定樣品中一定區域內的相位差或光程差。由於分開光束的方法不同,有不同類型的幹涉顯微鏡,以及用於測定非均勻樣品的積分顯微鏡幹涉儀。
幹涉顯微鏡主要用於測定活的或未固定的相互分散的細胞或組織的厚度或折射率。
微分幹涉差顯微鏡 一種特殊形式的幹涉顯微鏡,隻是其相幹光束分開的距離相當小,僅為1微米,有時還小於物鏡的最小分辨距離,因而二束相幹光都通過樣品,可觀察到樣品中光程差的局部差異(梯度)。
微分幹涉差顯微鏡用於觀察活的或未染色的樣品的精細結構,產生一種帶顏色的如浮雕般的反差像(圖2d)但不能用於定量測定。
熒光顯微鏡 用激發光照射樣品,根據樣品產生的熒光進行觀察的顯微鏡(圖2e)。生物學、醫學中應用的熒光有自發熒光、誘發熒光(包括酶或化學誘發)、熒光著色、免疫熒光等。熒光顯微鏡激發光照射的方式,有透射和落射兩種。
偏光顯微鏡 用於觀察雙折射樣品的顯微鏡。絕大多數結構有規則的生物體系的折射率因光波傳播方向而異,一般稱為雙折射體系,有分子(晶體)雙折射、形式雙折射、應力雙折射或幾種類型兼而有之。偏光顯微鏡的主要組成是在一般顯微鏡的光源和聚光鏡之間放置一個起偏(振)鏡,在物鏡和目鏡之間放置一個檢偏(振)鏡,並采用旋轉載物臺。調節起、檢偏振鏡的主截面使之互相垂直(正交位置),使在暗背景上顯出雙折射樣品的明亮像。此外,利用各種補色器可以定量測定雙折射的程度,進而推算出分子或顆粒在樣品中排列的方向。近有用遠紅外線作光源的顯微鏡,由於波長不受水的幹擾,反差也好,不用染色即可觀察活體。另外,還有利用紫外線做光源的顯微鏡,它用反射光學或特殊的晶體透鏡系統。
顯微鏡可根據不同用途對各種結構作適當的改變,形成許多其他類型。如比較顯微鏡、倒置顯微鏡、解剖體視顯微鏡、毛細管顯微鏡以及離心顯微鏡等。
近年來在光學顯微術的重大進展是共焦激光掃描顯微鏡(Confocal laser scanning microcope,CLSM)的應用,它大大的提高瞭影像的反差和分辨力。由於隻使物鏡焦面上的樣品成像,所以可對樣品進行“光切片”,並通過計算機樣品影像進行三維重組。
參考書目
谷祝平:《光學顯微鏡》,甘肅人民出版社,蘭州,1985。