液相色譜法

　　用液體作為流動相的色譜法。

　　簡史　1903年俄國科學傢М.С茨維特用於分離葉綠素所用的方法即液相色譜法。由於當時採用的柱填料顆粒大（100～150微米），移動相隻借助於重力作用緩慢地流過色譜柱，因此分析速度慢，分離效率低，被稱為經典液相色譜。20世紀60年代初期，由於生物和環境科學等方面的迫切需要，在氣相色譜（見氣相色譜法）理論和技術發展的基礎上，液相色譜才獲得瞭新的飛躍。液相色色譜動力學、熱力學過程和最佳條件選擇的理論研究，以及細粒度填料（3～10微米）、高壓輸液泵、梯度淋洗技術、各種高靈敏度檢測器的發展，使液相色譜在分析速度、分離效率和檢測靈敏度三方面都達到瞭與氣相色譜相媲美的程度。為瞭與經典液相色譜相區別，現代液相色譜又稱為高效液相色譜。

　　原理　高效液相色譜的基本原理與氣相色譜一致，不同點在於：液相色譜中溶質的擴散系數為氣相色譜的萬分之一到十萬分之一；液相色譜所用流動相的粘度比氣相色譜大100倍左右；液相色譜的流動相的組成對柱內吸附分配平衡的影響很大，常成為選擇分離過程最佳條件的主要因素，而氣相色譜的流動相對分離過程的影響一般是可以忽略的。根據固定相的不同，液相色譜分為液固色譜，液液色譜和鍵合相色譜。目前應用最廣的是以矽膠為填料的液固色譜和以微粒矽膠為基質的鍵合相色譜。

　　按固定相和流動相之間相對極性的大小分類，高效液相色譜又分為正相色譜和反相色譜。正相色譜是以矽膠或極性鍵合相為填料，以非極性溶劑為沖洗劑的色譜法。其特點是：①溶質的保留值隨其極性的增大而增大，隨沖洗劑極性的增大而減小；②溶質的保留機理是由固定相的極性吸附點與溶質分子的極性基團(親水性基團)相互作用，以及溶質與沖洗劑的相互作用所控制；③流動相的極性通常小於固定相的極性。

　　正相色譜主要用於族分離和異構體分離（包括幾何異構體和光學異構體）。由於一般正相色譜所用沖洗劑是易揮發的有機溶劑，分離後的餾分易於濃縮和富集，以便進一步進行定性分析，這對環境分析中多核芳烴的檢測和藥物化學、生化分析中的脂類、甾族化合物、維生素等結構相似的化合物分離特別有利。

　　一般認為，正相色譜的保留機理是吸附機理。已有許多理論定量處理這一吸附保留分離過程，例如L.R.斯奈德的頂替吸附理論、R.P.W.斯科特的多層吸附理論、D.E.馬丁的液體晶格統計力學理論和盧佩章的頂替吸附－液相相互作用統計熱力學理論。後者不僅適用於液固吸附色譜，也適用於鍵合相色譜和弱酸、弱堿、兩性化合物的分離。

　　反相色譜是由極性較小的物質作固定相，流動相的極性則較大。反相色譜常用的固定相是以矽膠為基質的烷基鍵合相，尤以十八烷基鍵合相應用最廣。沖洗劑多用乙腈－水或甲醇－水體系。反相色譜的特點是：①能使分子量和分子極性相差較大的各種樣品組分得到分離；②離子型樣品可通過第二化學平衡達到有效分離，例如在含水流動相中加入少量離子對試劑，或控制流動相的酸堿度；③在流動相中加入少量添加劑，能使幾何異構體和光學異構體獲得分離；④固定相表面非極性分子吸附力小，色譜柱系統能迅速達到平衡，易於操作。

　　反相色譜的保留機理仍在研究中，一般認為反相色譜的保留作用是由疏水性（非極性）作用力起主導作用。主要有三種觀點：①液－液分配過程；②與正相色譜相似的吸附過程，吸附力主要為比正相色譜的極性作用弱得多的色散力所貢獻，並應考慮液相分子間的相互作用力；③鍵合相分子和流動相中有機組分形成新的固定相，溶質分子在兩相間進行分配。

　　裝柱方法　高效液相色譜柱填料的發展極為迅速，60年代初發展的薄殼填料的柱效僅每米1000～3000理論塔片數。到60年代末，球型和無定型微粒矽膠（3、5、10微米等）以及以微粒矽膠為基質的鍵合相填料的柱效可達每米5萬到十幾萬理論塔片數。鍵合相的種類也日益增多，主要有氰基、氨基、醇基、烷基（包括C₁₈、C₁₆、C₁₄、C₁₂、C₁₀、C₈、C₂等系列），硝基、苯基等。此外還有有機膠填料。

　　高效液相色譜柱是細粒度填料制備和高壓淤漿裝柱技術相結合的產物。由於高效液相色譜填料粒度細，其表面活性強，采用常規氣相色譜的“幹裝技術”不能得到緊密均勻的柱床。高壓淤漿裝柱是把細粒度填料制成勻漿後，以高於500大氣壓的壓力裝入柱中而獲得高效柱。

　　高效柱的內徑一般為4.6毫米左右。細內徑柱越來越受到人們的重視，2毫米細內徑柱已商品化，1毫米內徑甚至0.20毫米內徑（又稱微型填充柱）也有許多報道。細內徑高效柱的使用大大降低瞭沖洗劑和樣品的消耗量，但對柱處效應則要求越小越好。

　　設備　基本部件是輸液泵、色譜柱和檢測器。為瞭適應多功能的要求，還可采用梯度沖洗裝置、進樣裝置、餾分收集裝置、恒溫控制裝置、數據處理裝置和微機控制系統等。（見彩圖）

液相色譜儀

　　輸液泵　它的功能是將沖洗劑（流動相）在高壓下連續不斷地送入柱系統，使樣品在色譜柱中完成分離過程。輸液泵有多種類型，按排液性質的不同可分為恒壓泵和恒流泵；按工作方式的不同又可分為液壓隔膜泵、氣動放大泵、螺旋註射泵和往復柱塞泵。前兩種為恒壓泵，後兩種為恒流泵，往復柱塞泵是高效液相色譜儀上采用最廣的一種（圖1）。

　　梯度沖洗裝置　梯度沖洗又稱溶劑程序，它是指在色譜分離過程中，沖洗劑的組成按一定的規律連續地改變，它的作用與氣相色譜中的程序升溫相似。液相色譜中沖洗劑的極性變化直接影響樣品組分的保留值，因此，梯度沖洗可改善復雜樣品的分離度，縮短分析周期和改善峰形。梯度沖洗裝置可分為低壓梯度（又稱外梯度）裝置和高壓梯度（又稱內梯度）裝置。低壓梯度裝置中，在常壓下將沖洗劑按預先規定的比例混合後，再由輸液泵輸入色譜柱。高壓梯度裝置中，由兩臺輸液泵分別將兩種極性不同的溶劑輸入混合器，經充分混合後進入色譜柱，這是泵後高壓混合形式。圖2是目前比較廣泛采用的低壓梯度裝置，可實現三元梯度沖洗。電磁比例閥的開關頻率由控制器控制，改變控制器程序即可得到任意混合濃度的梯度曲線。

　　進樣裝置　常用的進樣方式有三種：

　　①註射器隔膜進樣，適合於100千克力／厘米²以下的中、低壓范圍使用，是可獲得最高柱效率的一種進樣方式，但進樣重復性不佳。

　　②閥進樣，一般都是采用平面閥，有定體積進樣和可變體積進樣兩種類型，進樣量可從0.02微升到數百微升。這種進樣方式有較好的定量重復性，並適用於100千克力／厘米²以上的高壓進樣，但柱效有所損失。

　　③自動進樣器，由一個定體積進樣閥和一個多點采樣盤組成，由程序器或微處理機控制，適合於多種樣品重復分析和制備分離。

　　檢測器　主要有紫外吸收檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器和示差折光檢測器。紫外吸收檢測器使用最廣，它有三種結構型式：單波長式、多波長式和紫外－可見分光式。

　　單波長紫外檢測器（圖3）

具有靈敏度高、穩定性好、結構簡單、使用維護方便等優點。多波長式和紫外－可見分光式吸收檢測器擴大瞭波長工作范圍，而使應用范圍顯著擴大，並可獲得更好的 選擇性。

　　數據處理裝置和微型計算機控制系統　現代先進的高效液相色譜儀均配有計算機或積分儀，以自動處理數據、作圖並打印出分析報告。整機儀器的操作包括沖洗劑選擇、流速、柱溫、檢測器波長選擇以及進樣、梯度沖洗方式等，都由微型計算機控制。

　　應用舉例　高效液相色譜法在高分子化合物、對熱不穩定的化合物，生物活性物質和離子型化合物等方面的分離分析中顯示出其特殊的優越性。圖4為用矽膠作載體(又稱擔體)分離血清中維生素E的異構體所得的色譜圖。由色譜峰可以測出維生素E的異構體的結構（結構式如

）， R ₁和R ₂都是CH ₃時，是α-維生素E； R ₁為CH ₃，R ₂為H時，是β-維生素E； R ₁為H，R ₂為CH ₃時，是γ-維生素E； R ₁和 R ₂都是H時，是δ-維生素E。圖5為用反相色譜法分離氨基酸混合物時所得的色譜圖。

　　以疏水性作用為主要作用力的疏水色譜法已廣泛用於蛋白質混合物的純化和分離、分析中。其最大優點是在蛋白質分離過程中，高濃度的鹽組分不會改變蛋白質分子的幾何構型和生化活性。