對核酸的組成單元──核苷酸排列順序的測定。核酸的順序分析有助於揭示核酸結構與功能的關係。
去氧核糖核酸(DNA)的順序分析 1975年以前科學傢們曾從不同的角度探索測定DNA順序的方法。如將DNA轉錄成RNA,測定瞭RNA順序以後,應用互補原理推測DNA的順序;或用一種核糖核苷酸取代DNA中的去氧核糖核苷酸,而後用堿或核糖核酸酶(RNase)降解核糖核核苷酸鍵,以求出核苷酸的排列次序;又如將寡核苷酸片段的一端用放射性同位素標記,用外切酶逐個切去非標記端的核苷酸,用雙向電泳同系層析法將所得的酶解產物按不同電荷和鏈長分開以完成核酸的順序分析等;但這些測定方法都很費時,不夠精確,不能普遍應用,而且隻能測定一些小的DNA片段。1975年英國F.桑格建立瞭“加減法”推動瞭DNA順序的測定。桑格提出以測定已知末端核苷酸性質的DNA片段的分子長度來推測核苷酸的順序。這樣,過去用於測定生物高分子順序的基本方法──小片段重疊法的框框被突破瞭。此後發展起來的各種DNA、RNA順序測定的新方法都是以這個原理為基礎的。
目前被使用得最多的快速可靠的測定DNA順序的方法是:①F.桑格的雙脫氧法;②A.M.馬克薩姆和W.吉爾伯特的化學法。
雙脫氧法 基本原理是利用DNA聚合酶的聚合反應。在反應混合物中有模板、引物、酶、四種脫氧核苷三磷酸(如 dATP)和一定比例的2′,3′雙脫氧核苷三磷酸(如 ddATP)(圖1)。
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化學法 馬克薩姆和吉爾伯特利用能專一地修飾堿基的化學試劑,使相應的糖苷鍵變得不穩定,這樣也得到以特定堿基決定長度的4組DNA片段。硫酸二甲酯在二甲胂酸存在時可以使鳥嘌呤甲基化。甲基化鳥嘌呤的糖苷鍵是不穩定的,在堿性溶液中加熱,DNA的磷酸二酯鍵就會在脫鳥嘌呤處斷開。電泳之後在放射自顯影圖上顯示出一組由G降解而產生的DNA片段。為測定DNA中A的位置可用稀酸處理使之脫嘌呤,再用堿斷開磷酸二酯鍵,電泳圖譜上條帶即為A和G。對於嘧啶,可以利用水合肼處理,然後用哌啶催化β消除反應,使磷酸基團掉下。這種處理對C和T沒有選擇性。但如果在肼解時存在2M NaCl,則抑制瞭肼同T的反應,這樣產生的條帶相當於C的位置。
RNA的順序分析 RNA的順序分析方法可以分為兩大類,即片段重疊法和直接閱讀法。前者為經典方法,目前仍有人使用,後者為快速簡便的新技術,問世僅幾年已經使RNA順序分析研究出現瞭嶄新的局面。
片段重疊法 分別用二種以上的具有不同堿基專一性的核糖核酸酶將RNA分子水解成大核苷酸片段,然後分別分離和鑒定各水解產物,測定它們的核苷酸順序及其相對含量。二種不同專一性的酶得到的二組核苷酸片段是相互重疊的,因此使用更多專一性不同的酶水解 RNA分子,解析結構的能力就更強。設某 RNA片段的順序是ABCDCAD。可以使用二種專一性不同的水解酶,一種水解A和B,另一種水解D2結果如下:
水解A和B:A↓B↓CDCA↓D=A+B+CDCA+D
水解D:ABCD↓CAD=ABCD+CAD
這個片段的順序可以推斷為ABCDCAD。因為第1個酶解產物有CDCA順序,即該順序在原片段中是存在的。第2個酶水解得到ABCD和CAD二個片段,其可能的排列是ABCDCAD和CADABCD。但前者是唯一正確的,因為其中有CDCA順序的存在。
直讀法 原理與DNA順序快速測定法的原理相似,區別隻在於制備片段的方法不同。目前使用最多的制備片段的方法是:①利用專一性核糖核酸酶控制酶解的直讀法。如RNase A水解C和U;RNase T水解G;RNaseU2在適當條件下水解A;RNase phyl水解A、U和G,而對C的水解速度特別慢。如果RNA分子的5′端被32P標記,那麼用上述酶進行控制水解後,通過聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離,可得到幾組以5′端為放射性同位素標記的,3′端為某一特定堿基的片段。經放射自顯影後即可閱讀順序。此法受RNA二級結構影響較大,也讀不出修飾核苷酸。②化學直讀法。一般先用RNA連接酶將 RNA3′端接上放射性化合物32PCp。然後分別用硫酸二甲酯(修飾G)、焦碳酸二乙酯(主要修飾A)、肼(修飾U)、無水肼(在3M NaCl中主要修飾C)進行限制修飾,得到幾組以3′端為32P標記,5′端為特定堿基的片段。經變性凝膠電泳分離後,即可閱讀順序。此法受RNA二級結構的影響小,但也不能閱讀修飾堿基。③互補DNA(cDNA)直讀法。在四種脫氧核苷三磷酸存在下,反向轉錄酶以RNA為模板反轉錄成互補的cDNA,然後用DNA順序測定法測定cDNA的順序,再推導出原來的RNA順序。這種方法在測定mRNA和病毒RNA的順序中用得很多。由於cDNA同樣可以被克隆,因此測定方便。④末端鑒定的直讀法。在一定條件下,無離子水或甲酰胺可以使每一分子RNA隻有一個磷酸二酯鍵被水解,此水解無專一性,於是得到一組3′端的片段和一組5′末端的片段。用32P對5′端加以標記後,在聚丙烯酰胺凝膠電泳上按鏈長分離,切下凝膠條帶或轉移至DEAE-纖維素薄板上,經水解,鑒定它們5′末端的核苷酸,即可讀出RNA的核苷酸順序。此法受RNA二級結構的影響小,也能鑒定某些修飾堿基。但操作步驟較多,而且用於5′端同位素標記的激酶必須要很純,不含核糖核酸酶。