利用某些物質受光照射時所發生的螢光的特性和強度，進行物質的定性分析或定量分析的方法。
簡史 早在1575年，就有人在陽光下觀察到菲律賓紫檀木切片的黃色水溶液呈現極為可愛的天藍色。1852年G.G.斯托克斯用分光計觀察奎寧和葉綠素溶液時，發現它們所發出的光的波長比入射光的波長稍長，由此判明這種現象是由於這些物質吸收瞭光能並重新發出不同波長的光線，而不是由於光的漫射作用引起的。斯托克克斯稱這種光為熒光。這一名詞由發生熒光的礦物螢石(fluorite)衍生而來。20世紀50年代前使用濾片式熒光計，隻能測量熒光的總光度值。1955年制成第一臺熒光光度計。60年代開始瞭真實熒光光譜、熒光效率和熒光壽命的測量。70年代引進瞭計算機技術、電視技術、激光技術、顯微鏡技術。80年代，熒光分光光度計大多配有微型計算機－數據處理器，能對熒光光度值進行積分、微分、除法、減法和平均等運算。
原理 熒光的產生 大多數分子在室溫時均處在電子基態的最低振動能級，當物質分子吸收瞭與它所具有的特征頻率相一致的光子時，由原來的能級躍遷至第一電子激發態或第二電子激發態中各個不同振動能級（圖1a、圖b）。
其後，大多數分子常迅速降落至第一電子激發態的最低振動能級，在這一過程中它們和周圍的同類分子或其他分子撞擊而消耗瞭能量，因而不發射光（圖1c）。分子在第一電子激發態的最低振動能級停留約
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-9秒之後，直接下降至電子基態的各個不同振動能級，此時以光的形式釋放出多餘的能量，所發生的光即是熒光(圖1d)。某些熒光物質分子在降落到第一電子激發態的最低振動能級後，通過另一次無輻射躍遷降落至亞穩的三重線態，又受到熱激活作用再回到第一電子激發態的各個振動能級，最後由第一電子激發態的最低振動能級降落至電子基態而發出熒光。這種熒光因受激發光至發生熒光的時間較長，故稱為遲滯熒光（圖1e、g、h）。
產生熒光的第一個必要條件是該物質的分子必須具有能吸收激發光的結構，通常是共軛雙鍵結構；第二個條件是該分子必須具有一定程度的熒光效率。所謂熒光效率是熒光物質吸光後所發射的熒光量子數與吸收的激發光的量子數的比值。
熒光光譜和熒光激發光譜 使激發光的波長和強度保持不變，而讓熒光物質所發生的熒光通過發射單色器照射於檢測器上，調節發射單色器至各種不同波長處，由檢測器測出相應的熒光強度，然後以熒光波長為橫坐標，以熒光強度為縱坐標作圖，即為熒光光譜，又稱熒光發射光譜。讓不同波長的激發光激發熒光物質使之發生熒光，而讓熒光以固定的發射波長照射到檢測器上，然後以激發光波長為橫坐標，以熒光強度為縱坐標，所繪制的圖即為熒光激發光譜，又稱激發光譜。
紫外－可見光區熒光的產生，是由第一電子激發態的最低振動能級躍遷至電子基態的各個不同振動能級所致，而與熒光物質分子被激發至哪一個能級無關。因此，熒光光譜的形狀與激發光的波長無關。
物質的吸收光譜的第一吸收帶的形狀，決定於第一激發態的各個振動能級的分佈情況。躍遷的兩個能級之間的差距越大，吸收峰波長越短。熒光光譜的形狀決定於電子基態振動能級的分佈情況。電子基態的振動能級越高，兩個能級之間的差距越小，則熒光峰的波長越長。電子基態和第一電子激發態中能級的分佈情況是相類似的，所以，熒光光譜和吸收光譜的形狀相似，但卻呈鏡像對稱關系。
溶液的熒光強度 溶液的熒光強度與該溶液的吸光強度及熒光物質的熒光效率有關。對於某一熒光物質的稀溶液而言，每一平方厘米的截面上的熒光強度F可用下式表示：
式中φ為熒光物質的熒光效率；I0為每秒鐘每平方厘米上入射光的強度；ε為熒光物質的摩爾吸光系數；c為熒光物質的濃度；l為樣品池的厚度。由上式可見，在入射光強度與液池厚度不變的條件下，某一熒光物質的稀溶液(εcl≤0.05)的熒光強度與該物質的濃度成正比。
溶液的熒光強度還受到溶劑、溶液溫度和pH值的影響。溶液的熒光強度還會因熒光物質分子與溶劑分子或其他溶質分子的相互作用而降低，這種現象稱為熒光猝滅。
儀器 進行熒光分析的儀器稱為熒光分光光度計。它由以下五部分組成。
光源 熒光分光光度計多采用氙燈作為光源，因它具有從短波紫外線到近紅外線的基本上連續的光譜，以及性能穩定、壽命長等優點。近年來激光熒光分析應用日廣，它采用激光器作為光源，有氮激光器、氬離子激光器、可調諧染料激光器和半導體激光器等。染料激光器有連續波和脈沖兩大類。
單色器 是從復合光色散出窄波帶寬度光束的裝置，由狹縫、鏡子和色散元件組成。色散元件包括棱鏡和光柵。熒光分光光度計有兩個單色器：激發單色器和發射單色器。繪制三維熒光光譜（圖4）
時則采用正交多色器。所謂多色器系單色器去掉出射狹縫，正交指兩個多色器的入射狹縫互成空間垂直。
試樣容器 也稱樣品池，通常用石英或合成石英制成，玻璃容器因會吸收波長323納米以下的射線，不適用於323納米以下的熒光分析。對於溶液試樣的熒光分析，光源、試樣容器和探測器通常排成直角形，對於不透明的固體試樣，則排成銳角形。
檢測器 通常采用光電倍增管作為檢測器，靈敏度較高。三維熒光技術則用矽靶增強光導攝象管作檢測器。
顯示裝置 有表頭顯示、數字顯示和記錄器等。近年來熒光分光光度計大多配有微處理機，其信號經處理後在熒光屏上顯示，並輸給記錄器記錄。某些型號的熒光分光光度計，按下電鍵即可得出三維熒光光譜。
熒光分光光度計可分為單光束與雙光束兩種。在單光束熒光分光光度計中，光源發出的光經激發單色器單色化的光隻有一束，照射在樣品池上，樣品發出的熒光經過發射單色器色散後照射在光電倍增管上（圖2），然後用光度表進行測量。
雙光束熒光分光光度計經過激發單色器色散的單色光由旋轉鏡分為兩束，在不同瞬間分別將光會聚於樣品池和參比池上。樣品溶液和參比溶液發出的熒光進入發射單色器，然後照射在檢測器上（圖3）。
應用 無機化合物的定量分析 在紫外線照射下能發生熒光的無機物很少，但許多元素與有機試劑所組成的絡合物，在紫外線照射下會發生熒光，由其熒光強度和標準曲線可以測定該元素的含量。現在借助於有機試劑進行熒光分析的元素已達60餘種。至於非金屬元素（如氟、氯、溴、碘、硫等）或過渡金屬元素（如銅、鐵、鈷、鎳、汞等）則可用熒光猝滅法進行測定。
熒光分析法的靈敏度很高，一般為微克／升，較紫外-可見分光光度法高二、三個數量級，與原子吸收光譜法相近。如采用激光時間分辨熒光法，靈敏度還可大大提高。例如，測定海水中鈾的檢出限可達0.04微克/升，測定銪的檢出限可達2皮克／升。
有機化合物的定量分析 芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，易於吸光，其中龐大而結構復雜的化合物在紫外線照射下都能發生熒光。如采用溶劑萃取、色譜法、電泳等方法預先加以分離而後進行熒光分析，常可測定它們在試樣中的低微含量。熒光分析與高效液相色譜法密切結合，已成為該法的檢測工具。
定性分析 熒光激發光譜和熒光光譜可作為定性分析的一種手段，用以鑒定有機絡合物。根據試樣的圖譜和峰波長與已知樣品進行比較，可以鑒別試樣和標準樣品是否同一物質。對於復雜混合物中的同分異構體，室溫熒光光譜的波帶太寬，難於鑒別，但如冷卻至77開的低溫，可獲得高度分辨的熒光光譜，足以檢測復雜混合物中的個別分子。此法曾用於原油中各種三環雜氮化合物的鑒別。近年來還采用同步掃描熒光法及1～4級的導數熒光光譜來鑒別多組分熒光物質。
芳基的鑒定 光離解反應常生成自由基，但自由基存在的時間很短，難於鑒定。隨著激光熒光法的發展，建立起皮秒脈沖激光熒光法，可用於鹵素芳族化合物的光離解反應的研究並用以鑒別所生成的自由基。在某一波長的皮秒激光脈沖的激發誘導下，鹵素芳族化合物發生光離解反應，C-X鍵分裂而生成自由基，用較第一種激光脈沖延遲數十皮秒的另一波長的皮秒激光脈沖進行激發，並繪制熒光光譜，可以對這些自由基進行鑒定。
進展 70年代以來，熒光分析法在儀器、方法、試劑等方面的發展都非常迅速。激光熒光法的建立使熒光分析又有進一步的提高。激光具有下列特征：①光子通量大，峰值功率高；②空間相幹性好，可將光束精確定位於小范圍內；③時間相幹性好，可得皮秒短脈沖，使檢測系統將激發信號和發射信號分開；④譜線窄且波長可調。由於激光可聚焦成很小的光斑，使用不到1微升的試樣便可進行熒光分析，這極有利於生物化學的研究工作。例如，采用氮激光器的激光熒光法測出紅血球中鐵的平均含量為10-13克，單個精子中鋅的含量為10-15克。采用脈沖染料激光器配用盒式積分器處理的延遲線，可建立納秒的時間分辨激光熒光法，它具有在時間和波長尺度上分辨不同組分的能力；與高效液相色譜法相配合，可用於湖水中及空氣懸浮顆粒物中致癌物質多環芳烴的檢測。對於苯並[a]芘的檢測限可達0.2皮克。采用Nd3+－釔鋁石榴石固態振蕩器或同步泵浦染料激光體系，可得到皮秒激光脈沖，曾用於有機分子的振動張弛、光分解反應、雙核金屬絡合物內電子轉移等項研究。70年代曾提出同步激發技術，從而得到同步激發熒光光譜。此後又將同步激發與導數光譜兩種技術結合起來，大大提高瞭多組分混合物熒光分析的選擇性，成為多組分混合物定性及定量分析的有效手段之一。
三維熒光光譜能獲得激發波長和熒光發射波長同時變化的熒光光度信息。它的三種空間坐標分別表示發射波長、激發波長和熒光強度（圖4）。這種技術可用於多組分混合物的定性和定量分析，例如船舶污水的分析和多環芳烴混合物的分析等；還可用於多組分光化學反應動力學過程的研究。
除上述各種方法外，利用熒光偏振、能量傳送或熒光壽命的熒光免疫分析也已取得廣泛的應用。