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染色體工程
動物細胞的染色體工程
植物細胞的染色體工程
染色體的消除
染色體的添加
染色體的替代
染色體組工程
染色體組工程的方法
多倍體的誘發
單倍體的誘發
染色體組工程的應用
細胞質工程
細胞質工程的方法
去核和核移植
細胞重組
細胞質工程的應用
動物方面
植物方面
細胞融合工程
細胞融合的方法
動物細胞雜交或細胞融合
植物體細胞雜交
細胞融合工程的應用
基因定位
單克隆抗體
作物品種改良
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應用細胞生物學和分子生物學方法，在細胞水平進行的遺傳操作。廣義的細胞工程包括利用離體培養細胞的特性，生產有價值的生物品，或快速繁殖珍貴的植株。
對細胞的遺傳操作可以在細胞結構的不同層次上進行。將體外重組的基因導入細胞，實際上是與基因工程交叉的領域（見重組DNA技術）。除此以外，按遺傳操作對象的結構層次，細胞工程可分為4個方面：染色體工程、染色體組工程、細胞質工程、細胞融合工程。
染色體工程
將一種生物的特定染色體，按照人們的意圖予以消除、添加、或同別的生物的染色體置換、或改造的技術。目前基因工程的操作技術多限於單個或少數基因在大腸桿菌等微生物中的表達。為瞭改變真核細胞的遺傳性和控制高等生物的生命活動，還必須研究和開發染色體工程，建立一種新的技術體系，把所需的基因或染色體片段整合到染色體的任意位置，並能將有關遺傳信息在細胞分裂中一代又一代的傳遞下去。目前這方面的工作還處於起步階段。
動物細胞的染色體工程 又稱為染色體轉導，或染色體介導的基因的轉移。染色體轉導術，目前有兩類，其一，稱為微細胞轉移術。應用低濃度秋水仙素長時間處理可使細胞微核化，經去核處理後，可得到隻含相當於幾個乃至一個染色體的微細胞。微細胞被導入完整細胞以後仍顯示RNA合成，因而微核編碼的基因信息可望在微細胞異核體內表達出來。如小鼠的微細胞可被導入至另一品系的小鼠或倉鼠乃至人的HeLa細胞內。電泳檢測顯示存在著小鼠基因型的大分子物質，如脂酶D、嘌呤核苷磷酸化酶和肽酶 B。已知前兩種酶的結構基因定位於小鼠的第14號染色體上。提示小鼠的該號染色體已進入宿主細胞內並行使其功能。
另一種方法是先誘發細胞同步分裂，繼用秋水仙素阻抑細胞分裂於中期，再破碎細胞，通過離心收集大量的中期染色體。有人把此法得到的人或倉鼠的中期染色體轉移到小鼠細胞內，並探查到有特異的供體基因的功能產物，如胸苷激酶(TK)與次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)。並推測整合到宿主小鼠內攜帶TK基因的染色體片段約大於17000個堿基。有人證明通過染色體介導的基因轉移，不僅在宿主細胞的分裂過程中能穩定地傳給子代，而且還能進行連續轉移，如人染色體基因可以轉移到小鼠細胞內，然後再使用同樣的技術從小鼠細胞轉移到中國倉鼠細胞內。這些實驗是在染色體水平上進行基因轉移的良好開端。
植物細胞的染色體工程 在高等植物方面的染色體工程，目前還僅在六倍體普通小麥與其他種、屬之間做過。六倍體普通小麥的染色體組型是由野生一粒小麥AA、小斯卑特山羊草BB和匯山羊草DD三種類型的染色體組融合而成，是一種能正常繁殖的種間雜種(AABBDD)，因此，很容易容納其他種、屬染色體添加或替代。這個領域的研究目的在於改良作物品種和探究物種起源。
染色體的消除 ①單體植物，起初是利用自然發生的單倍體普通小麥制作。現在則用人工誘導花粉或未受精的子房產生的單倍體植株為材料進行。這是因為普通小麥的單倍體植株隻有21條染色體，都不是成對的，因此在成熟分裂（見減數分裂）時沒有聯會的對象，故仍為單價染色體。這21個單價染色體能排列在赤道板上縱裂為二，在後期Ⅰ被平均分配到細胞的兩極。但在第二次分裂時，這21個染色體不再縱裂，隨機分開，結果產生瞭染色體數從0～21個的21種類型的配子。這些配子隻有具19條或20條染色體的有受精能力。因此，如果用正常植株的花粉(n＝21)給單倍體植株授粉，n＝20的卵細胞以一定的比例受精，結果得到2n＝41的植株。其染色體組型中有20條染色體因有同源(對應)染色體故可以配對形成二價染色體。而隻有一條染色體沒有配對，成為單價染色體，因此稱這種類型的植物叫單體植物。例如，美國米蘇裡大學的E.R.西爾斯於1937～1954年共用瞭十七年的時間，用中國春小麥中發現的兩個單倍體植物與正常花粉授粉，得到的後代中找到瞭5種單體植物。其後用同樣方法制作一套21種單體植物。除普通小麥外，煙草和硬粒小麥也制成瞭一套單體植物。②缺對植物，單體植物的體細胞染色體數為2n＝41。在成熟分裂後，將形成兩種配子，即n＝21，n＝20，這兩種雌雄配子都有受精能力，而且自花授粉後也容易結實。不過兩者受精率的高低有差別。因此，受精時，兩種配子按一定比例進行結合。結果見表1。如果缺失型的花粉與缺失型的卵細胞結合為受精卵，由此發育成的植物，將比通常的普通小麥少一對染色體，所以叫缺對植物。E.R.西爾斯用此方法也培育出瞭一套普通小麥缺對植物。
表1 單體植物自花授粉得到的下一代植物種類和頻率（受精率%）
染色體的添加 ①同種染色體的添加，所添加的染色體來自同種個體，添加一個的叫三體植物(2n+1)；添加一對的叫四體植物(2n+2)。三體植物和單體植物一樣，可得自單倍體三倍體或缺體。它的來源很多。如普通小麥單體植物在成熟分裂時，有時會出現不分離現象（即單價染色體的二個姊妹染色單體在後期Ⅰ被同時拉到同一極，而不是各自分配到兩極）。結果所形成的四分孢子，其中三個的染色體數是n＝20，一個是n＝22。如果多一個染色體的配子與正常花粉或卵細胞(n＝21)受精後，就成為三體植物(2n＝43)，比原來正常普通小麥多瞭一個染色體。三體植物自花授粉的後代中就有四體植物出現。因為三體植物在成熟分裂時形成兩種配子(n＝21，n＝22)。如果讓三體植物自花授粉，就會出現三種類型的子代，如表2所示。其中就有新型的四體植物，比正常植物多兩條染色體。②異種染色體的添加，所添加的染色體來自別種植物。以普通小麥(W)和黑麥(R)2n＝14雜交為例(圖1）。由於黑麥染色體不能和普通小麥配對，在成熟分裂染色體重組時，黑麥基因不能直接轉移到小麥染色體上，而隻能將黑麥整個染色體組加到小麥的染色體組中，所得子一代雜種為多倍單倍體(21′W7′R)，僅28個染色體。經過秋水仙素處理加倍後，成為小黑麥八倍體(21″W7″R)共有56個染色體，再與小麥回交得到七倍體(21″W7′R)，共49個染色體。然後與小麥再回交一次，就可得到外加的單體植物。單體植物自交後得二體植物(44個染色體21″W1″R)。另外，還有一個外加系是加入瞭黑麥第Ⅱ對染色體，成為44個染色體的二體植物。這種外加系能使小麥抗銹病（見染色體倍性）。
表2 三體植物自花授粉後代的情況
染色體的替代 用同種或異種染色體來替代某特定染色體的技術。其目的是要把已知道的具有抗病或其他有利特性的某一染色體來替代另一個具有其他性狀的染色體，以改良作物品種。染色體替代有三種方法：①用普通小麥自身的染色體來替代。例如，普通小麥的一對1A染色體被一對1B染色體替代後，就能育成缺對1A、四體1B植物，即缺對-四體植物。這種類型的植物是由缺對1A與四體1B雜交後所得子一代再自花授粉後選育而成。②普通小麥的一個品種的染色體用別的品種的染色體來替代，叫做同種染色體替代。如果用正常普通小麥B品種的花粉，與缺對的A品種雜交，所得子一代自花授粉，則在子二代就能選育出A品種的缺對的二條染色體被B品種染色體替代的植物。③用異種植物的染色體來替代，叫異種染色體替代。例如，普通小麥的2A染色體可用黑麥的2R染色體替代。為瞭達到這個目的，首先要育成基本材料缺對植物(2n＝42-2A)和異種染色體外加系(2n＝42+2R)。這樣就可把普通小麥缺對2A與小麥2R染色體外加系（具有21對小麥染色體加上一對黑麥2R染色體）雜交，子一代雜種染色體2n＝42，其中20對染色體是除2A外的全部普通小麥染色體，其餘二個一價染色體是2A和2R，成熟分裂時可產生四種類型配子，即：n＝20+2A+2R，n＝20+0，n＝20+2A＝21，n＝20+2R＝21。這最後一種是具有除2A以外的20個普通小麥染色體一個黑麥的2R染色體。因此，子一代雜種自花授粉的後代中，就能得到所期望的異種染色體替代植物。即一對黑麥的2R替代瞭一對小麥的2A(20″W2″R)。
現在，應用染色體工程的方法，在許多添加和替代染色體工作中，已經獲得瞭不少有遺傳學和育種學價值的品系。例如，獲得瞭添加單個冰草染色體的小麥品系中間，有的能抗粉露菌病、稈銹和葉銹。這種抗性均呈現顯性單因子遺傳。將黑麥第Ⅲ對染色體加到軟粒小麥對粉露菌病有抗性。用冰草的一個染色體替代軟粒小麥染色體3D，使軟粒小麥對稈銹有抗性。這些在生產實踐上都有實用價值。
染色體組工程
誘導增加或減少一個生物體內整套染色體組數的技術。增加同種染色體組數的叫同源多倍體；增加異種染色體組數的叫異源多倍體，異源多倍體必須經過雜交才能得到（圖2）（見染色體倍性）。
染色體組工程的方法 多倍體的誘發 自1937年發現瞭用秋水仙素誘發多倍體的方法以來，一般常用藥劑（秋水仙素、富民隆等），也可用高溫處理來誘發多倍體。其法是把植物的種子或幼芽浸在0.05～0.2％的秋水仙素水溶液中，處理24～96小時即可得到很好的效果。例如四倍體西瓜、甜菜、玉米和百合等都是用此法獲得的(圖2）。
現在，由於原生質體分離技術的發展，也可從原生質體的融合得到多倍體。例如用聚乙二醇作誘導融合劑處理胡蘿卜原生質體後，得到瞭頻率相當高的四倍體和六倍體植株。這是來源於二個或三個原生質體融合的結果。
單倍體的誘發 60年代以來，子房、花藥或花粉離體培養成功，很易從大孢子、卵細胞或小孢子等得到單倍體植株。其法是將一定時期的花藥或子房移植到特定的培養基上培養。待生長愈傷組織或胚狀體後，再移到分化培養基上，分化出苗和根，長成完整的小植株即可移到盛有土壤的盆中繼續栽培到開花。單倍體植物一般不能結實或僅結少量種子。
此外，還可用遠緣雜交，X射線或紫外線照射，化學藥品如馬來酰肼、甲苯胺藍、氯黴素等以及異源胞質等方法都能誘導單倍體產生。1970年有人又用大麥與球莖大麥雜交後染色體消除的方法，產生高頻率的單倍體，有的可高達68.5％。在雜交後，球莖大麥的7個染色體就消除在胚中，留下的是大麥的7個染色體，成為單倍體的胚及小植株。經秋水仙素處理後，染色體加倍形成純合二倍體。
染色體組工程的應用 誘導多倍體在植物育種上的應用是有限度的。由於作物類型不同，對多倍性誘變反應也不同。原來的倍性水平、染色體組的結構、繁殖方式、多年生性、植株實用部位，所有這些都關系到育種的成敗。最適宜用染色體加倍方法改良的作物應該具有：①染色體數目較少，②以收獲營養體為主，③異花授粉，④多年生和營養繁殖的習性等條件。這些都是多倍體育種獲得成功的先決條件。
細胞質工程
研究真核細胞的核、質相互關系以及細胞器，胞質基因的轉移等細胞拆合的技術，所以又叫細胞拆合工程。主要研究內容是細胞質的置換。過去在植物上置換的方法是進行連續回交。例如，為瞭研究柳葉菜屬的細胞質遺傳，曾連續回交瞭二十五代，結果還不能把全部母核替代出來。現在由於核移植和原生質體的分離方法的改進，推進瞭這項工程的進展。
細胞質工程的方法 去核和核移植 動物細胞核的移植一般都用顯微操作器進行。50年代初期，美國生物學傢R.佈裡格斯和T.金首先成功地把豹蛙囊胚期細胞的細胞核移植到去核的蛙卵，並能正常發育。後來，英國J.B.格登把爪蟾蝌蚪腸上皮細胞核移植到去核卵內，能發育到有生殖能力的成體。中國童第周等還成功地進行金魚類異種、異屬之間的核移植實驗(見細胞分化)。70年代以來，體外培養的動物細胞的去核，是先用細胞松弛素B處理細胞，再高速離心使細胞核與細胞質分開。分離出來的核，帶有少量胞質並圍有質膜，稱為“核體”或“小型細胞”。核體能重新再生其胞質部分，繼續生長、分裂。去核後的胞質部分，仍由膜所包圍，即為“胞質體”或“去核細胞”(圖3）。秋水仙素及其衍生物和長春新堿等也能誘發某些哺乳類細胞排核。目前制備胞質體和核體的方法目臻完善，純度可達99％左右。胞質體約可存活18～36小時。
植物細胞核的移植，在低等植物如單細胞傘藻，可把新鮮材料的假根切下，放在玻片上用玻棒擠壓，使細胞的內含物壓出在一滴適合的培養液中，反復沖洗幾次，然後在顯微鏡下觀察，一直到核周圍無細胞質為止。離心分離後待用。高等植物如矮牽牛、天仙子、煙草、番茄等原生質體核的分離，可先在懸浮的原生質體中用蒸餾水將懸液沖淡一半，約30分鐘後，原生質體破裂，放出細胞核與葉綠體，就可在0.6M蔗糖液中離心和收集核，然後存放在一定的培養液中待用。1978年以來又借用動物細胞去核的藥劑細胞松弛素B來處理原生質體，加上高速離心，使原生質體分離成二部分，即：無核原生質體和小原生質體。開辟瞭去植物細胞核甚至去部分染色體的新途徑。
細胞重組 已經分離的核體（小細胞）與胞質體在融合因子的介導下重新融合，構成“重組細胞”，這一技術即稱為細胞重組，胞質體與另一完整細胞融合，即產生“胞質雜種”細胞。這兩種細胞產生的效果是不同的，現在有方法把它們鑒別開。以大鼠二種成肌細胞為材料，一種是正常的具有次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖基轉移酶(HGPRT+)基因，另一種是突變體缺少這種基因(HGPRT-)，因此，前者細胞中有轉移酶能被氚-次黃嘌呤標記，而後者沒有這種酶，便不能標記。在兩者的細胞質中讓HGPRT+攝取小乳膠顆粒，讓HGPRT-攝取大乳膠顆粒，以顆粒的大小來作標記。當核體（小型細胞）與胞質體融合後，在重組細胞中可看到核被氚-次黃嘌呤所標記，在細胞質中有大量大乳膠顆粒和極少數小乳膠顆粒。當胞質體與另一個HGPRT+完整細胞融合後的胞質雜種細胞的細胞質中，則同時出現有大量的大、小乳膠顆粒。如圖4所示。應用這種方法很容易把兩類細胞鑒別出來。
在植物中，原生質體與核的融合以煙草、矮牽牛的核移植為例，其步驟是：①先使矮牽牛遊離核與煙草原生質體各自懸浮並沉淀在0.25M硝酸鈣溶液中，pH6；②去掉上清液，再把它們懸浮起來，以適當比例使核與原生質體在試管中混合、離心，隨後加入45％聚乙二醇溶液1毫升使之聚合：③30分鐘後，徐徐加入4毫升0.2M硝酸鈣(被pH9的甘氨酸氫氧化鈉所緩沖)以誘導融合攝取核；④15分鐘後加0.2M硝酸鈣(pH6)；⑤再過20分鐘，原生質體用培養液沖洗；⑥鏡檢後，將具有雙核的（其中一個是矮牽牛的核）煙草原生質體進行培養。
細胞質工程的應用 動物方面 1974年有人用兩種小鼠成纖維細胞，其一用L細胞的完整細胞，它的核內具有對5-溴脫氧尿苷抗性的核基因BUd(RR)，但細胞質內沒有抗氯黴素的胞質基因，用的另一個細胞的線粒體上帶有抗氯黴素的胞質基因CA(PR)，而細胞核內帶有硫代鳥嘌呤敏感核基因(TGS)，把後者去核細胞與前者融合（圖5），則融合後的胞質雜種細胞既能抗5-溴脫氧尿苷（BUdR），又能抗氯黴素(CAP)。但如果把親體細胞(BUdRR和TGS)同時培養在含有這兩種藥物的培養基上，則都將死去。因為這兩種細胞一個對CAP敏感，另一個不抗BUdR，而胞質雜種細胞則兩者都能抗，不但能存活而且還能增殖。
植物方面 用等滲密度梯度高速離心後，也可得到兩種亞原生質體，①在低密度范圍內可得到胞質體（去核原生質體）；②在高密度中，可得到小原生質體（核質體）。現在已能自玉米、煙草和胡蘿卜細胞得到這兩種亞原生質體。生化實驗證明：去核原生質體代謝作用很低，而小原生質體由於減少瞭表面積和體積（僅及原生質體的10～15％），因此，攝取物質快，合成蛋白質也快，培養時發育迅速，是一種研究核質關系的好材料。由於這項工作才開始，迄今尚無明顯結果。
細胞融合工程
細胞融合是指用自然或人工的方法，使兩個或幾個不同的細胞融合成一個細胞的過程。細胞融合的結果，一個細胞中含有兩個不同的細胞核，則稱為異核體；隨後的有絲分裂中，來自不同細胞核的染色體可能合並到一個結合核內。因此，又稱為體細胞雜交。細胞融合的范圍很廣，從種內、種間、屬間、科間一直到動、植物兩界之間都進行瞭嘗試。在植物方面，由於各類細胞具有全能性，在煙草、矮牽牛、胡蘿卜等種間雜種，馬鈴薯和番茄、曼陀羅和顛茄、煙草和矮牽牛等屬間雜種都已獲得瞭再生植株。在動物方面人和鼠體細胞雜交，雖然不能長成一個新個體，但能作基因定位的材料。因此，這項新技術，在理論研究和工、農、醫方面的應用，均有廣闊的前景。細胞融合技術的發展，歷史很短。自1960年在體外培養中發現雜種細胞以來，僅20多年。1965年岡田善雄等和H.哈裡斯等各自用滅活的仙臺病毒誘導產生瞭第一個種間異核體。1970年已應用人與鼠的細胞雜交系統地進行瞭人類染色體基因的定位工作。在植物方面，1960年E.C.科金首先使用纖維素酶分離番茄幼根的原生質體獲得成功。1970年他們又成功地使種間原生質體融合在一起。1972年P.S.卡爾森等又從融合的原生質體獲得瞭第一株種間細胞雜種。到1980年為止，種間融合的再生植株已有16種之多。
細胞融合的方法 動物細胞雜交或細胞融合 將兩個不同種的親本細胞A和B，以滅活的仙臺病毒或聚乙二醇(PEG)為融合誘導劑，使A和B兩細胞融合成為一個具兩個遺傳性不同核的異核體（如遺傳性相同的核融合在一起叫同核體）。隨後異核體經有絲分裂成為兩個具有A和B兩親本的雜種融合核。AB雜種經多次分裂，B親本的染色體會逐漸減少到一個或完全消失(圖6)。
植物體細胞雜交 ①原生質體的分離。植物細胞之間有果膠質粘連，每個細胞之外還有一層纖維素組成的壁，因此，在分離原生質體時，首先要在一定濃度的酶液(果膠酶與纖維素酶)中保溫，消去果膠質與纖維素後才能使原生質體分離出來。②原生質體的融合。不同種之間原生質體的融合，須選用一種融合誘導劑(聚乙二醇，或高鈣CaCl2.2H2O，0.05M溶於甘露醇0.4M和pH10.5)誘導融合。它們的誘導率可達20～50％。③雜種細胞的選擇與培養。細胞融合後要把雜種細胞選擇出來。一般都利用各種生化指標和遺傳標記來選擇和鑒定。例如，使用天然的或人工誘變的突變體，如白化苗、營養缺陷型、抗藥性突變體等，或根據不同材料對激素敏感性不同，生長差異等，來設計適合的選擇系統。如果融合的原生質體一個是白化，另一個具葉綠體，就可用機械的方法，把融合的細胞在倒置顯微鏡下把它們挑選出來進行培養。這些細胞培養到各個發育階段，如愈傷組織、分化苗和根，都需要更換培養基，才能使它們順利地再生成植株。
細胞融合工程的應用 基因定位 利用體細胞雜交後基因的互補性和染色體丟失來確定基因的位置。例如，小鼠成纖維細胞缺少次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖基轉移酶的突變體(HGPRT-)作為一個標記體。當小鼠單獨培養在含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT)的培養液中，因缺少HGPR基因，不能由次黃嘌呤合成核苷酸而死亡。但小鼠HGPRT-細胞和人的HGPRT+細胞融合的雜種細胞培養在HAT培養液中，就能存活，這就是兩者起瞭互補的作用。而在雜種細胞中，人的染色體，除瞭一條活動的X染色體外，其餘的全部丟失瞭，說明HGPRT基因是在X染色體上（見體細胞遺傳學）。
單克隆抗體 見單克隆抗體。
作物品種改良 植物體細胞雜交對植物育種和作物改良有著美好的應用前景。例如，現在有人把擬南芥菜和油菜體細胞融合在一起，育成瞭一種帶有兩個親本遺傳特性的新植物，叫擬南芥油菜，這種雜種具有親本之一的大部分遺傳物質和另一親本的少數染色體，它們的形態上較正常，這一結果表明在遠緣體細胞雜交方面，有可能把某些帶有優良性狀的染色體或基因轉移過來，為作物改良開辟瞭一條新的途徑。
參考書目
常脅恒一郎：高等植物的染色體工程學，《化學と生物》，日本，10(1)/1972.
N.R.Ringertz，R.E.Savage，Cell Hybrids，AcademicPress，New York，1976.
J.Reinert，Y.P.S.Bajai，Plant Cell，Tissue，Organ Culture，Springer Verlag，Berlin，New York，1977.